杨松，熊依军，邹韬，杨兴明，黄文岳

（南充市红十字中心血站，四川637000）

·调查报告·

南充地区无偿献血者D变异体血清学鉴定

杨松，熊依军，邹韬，杨兴明，黄文岳

（南充市红十字中心血站，四川637000）

目的研究四川省南充地区初检为Rh阴性无偿献血者中D变异体血清学表型。方法对433份初检为Rh阴性的血样（来自于2010年4月至2014年9月四川省南充地区无亲缘关系的154 392名汉族无偿献血者）用间接抗球蛋白试验鉴定D变异体，再用吸收放散试验从间接抗球蛋白试验阴性的血样检出DEL型，对所有血样进行不规则抗体筛选鉴定。结果433份送检标本中共确认Rh阴性402例（92.8%，402/433），检出23例D变异体（5.3%，23/433），其中DvccEe 8例（34.8%，8/23），DvCcee和DvCcEe各6例（分别为26.1%，6/23），DvCCee 3例（13.0%，3/23）；检出DEL型3种表型105例，其中DelCcee 87例（82.9%，87/105），DelCCee 16例（15.2%，16/105），DelCcEe 2例（1.9%，2/105），均与C抗原相关；在D变异体和DEL型献血者血浆标本中未检出不规则抗体。结论通过该次调查，掌握了四川省南充地区初检为Rh阴性献血者D变异体血清学表型，对于指导临床输血及预防新生儿溶血病等具有重要意义。

供血者；血清学；四川；D变异体；DEL型；不规则抗体

Rh血型系统是人类最具多态性的血型系统，其临床意义仅次于ABO血型系统，可引起溶血性输血反应、新生儿溶血病及自身免疫性溶血性贫血等[1]。Rh血型系统中与临床输血关系密切者主要为D、C、c、E、e 5种抗原，其中D抗原的免疫原性最强，其次为E抗原。红细胞表面有D抗原者称为Rh阳性，缺乏D抗原者称为Rh阴性。但有研究发现，D抗原存在多种变异体（D variant，Dv），包括弱D、部分D和DEL型。DEL型是一种特殊的D变异体，红细胞上表达非常低的D抗原不能用常规血清学方法检出，只能用吸收放散试验进行筛选。近年来，相关文献陆续报道了输注D变异体红细胞可使Rh阴性患者产生抗-D抗体，甚至D抗原数量极少的DEL型红细胞也会引起免疫反应[2-3]。作者采用血型血清学方法在四川省南充地区初检Rh阴性无偿献血者中筛查D变异体，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源初检Rh阴性标本433例来自于2010年4月至2014年9月四川省南充地区无亲缘关系的154 392名汉族无偿献血者，重复献血者只计为1例。待确认的标本为同源血袋导管内血液，全血枸橼酸盐抗凝。将血袋导管内血液放入干净试管，离心分离红细胞和血浆，血浆用于不规则抗体筛选鉴定，而红细胞经生理盐水洗涤3次后制成3%～5%红细胞生理盐水悬液，用于Rh阴性确认试验、Rh血清学表型检测和DEL型鉴定。

1.1.2 试剂与仪器抗-D（IgM）、抗-D（IgG）、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、多特异性抗IgG+C3d、筛选细胞、谱细胞均为上海血液生物医药有限公司产品，凝聚胺介质试剂为珠海贝索生物技术有限公司产品，抗-D（IgM、IgG）为英国Millipore公司产品，人源抗-D血清为江阴力博医药生物技术有限公司产品，乙醚为常熟市杨园化工有限公司生产，血型血清学专用离心机KA-2200为日本久保田公司生产，血库标准化离心机2005-1为珠海Baso生产。

1.2 方法

1.2.1 Rh阴性确认试验用抗-D试剂（IgM）采用试管盐水法对送检标本进行复查，明确在盐水介质下有无凝集和凝集强度。随后采用3种不同厂家抗-D（IgG）试剂进行间接抗人球蛋白试验进行确认，具体方法：3支做好标记的试管分别滴入不同厂家抗-D（IgG）试剂1滴，再滴入被检红细胞悬液1滴，混匀后置于37℃水浴箱孵育30 min，用生理盐水洗涤3次，沥干后再滴加1滴抗人球蛋白试剂，混匀后3 400 r/min离心15 s，最后轻轻摇动试管，观察有无凝集及凝集强度。同时，做阴、阳性对照试验，确保试验结果的可靠性。

1.2.2 Rh血清学表型鉴定分别用抗-C、抗-c、抗-E、抗-e单克隆试剂采用试管盐水法对送检标本进行Rh系统重要抗原分型，同时做阴、阳性对照试验，确保试验结果的可靠性。

1.2.3 乙醚吸收放散试验鉴定DEL型先将间接抗人球蛋白试验阴性者红细胞和等量人源抗-D（IgG）血清37℃水浴箱孵育60 min。取经彻底洗涤的受检压积红细胞1份，加1份生理盐水、2份乙醚，用木塞盖紧，颠倒摇匀10 min，然后以1 500×g离心5 min。离心后即分为3层，最上层为乙醚，中层为红细胞基质，下层为具有抗体的放散液。将放散液置37℃水浴30 min，除尽乙醚，然后加入O型Rh阳性红细胞悬液1滴，再进行间接抗人球蛋白试验，观察有无凝集，有凝集者判定为DEL型。

1.2.4 不规则抗体筛选和鉴定使用筛选细胞，采用试管盐水法和凝聚胺法对所有送检标本血浆进行不规则抗体筛选，如检出不规则抗体再用谱细胞通过抗人球蛋白试验进行抗体鉴定。Rh阴性确认试验、红细胞血型抗原检测、吸收放散法和不规则抗体筛选鉴定均严格按照《全国临床检验操作规程》第3版和相关试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 Rh阴性确认情况433例初检Rh阴性标本中共确认Rh阴性402例（92.8%，402/433），检出23例D变异体（5.3%，23/433），RhD初检错误8例（1.8%，8/433）。Rh阴性者在四川省南充地区无偿献血人群中的比例为0.3%（402/154 392）。

2.2 Rh阴性献血者D变异体和DEL型Rh重要抗原分型Rh阴性献血者共检出5种表型，其中dccee 201例（50.0%，201/402），dCcee 150例（37.3%，150/402）。通过间接抗人球蛋白试验，检出D变异体4种表型，其中DvccEe 8例（34.8%，8/23），DvCcee和DvCcEe各6例（分别为26.1%，6/23），DvCCee 3例（13.0%，3/23）。通过吸收放散试验，检出DEL型3种表型，其中DelCcee87例（82.9%，87/105），DelCCee 16例（15.2%，16/105），DelC-cEe 2例（1.9%，2/105），见表1。

表1 Rh阴性者D变异体和DEL型献血者Rh重要抗原表型分布[n（%）]

2.3 抗体筛选和鉴定在D变异体和DEL型献血者血浆中均未检出不规则抗体。

3 讨论

Rh血型有着复杂而丰富的遗传多态性，不仅RhD阴性分子遗传机制呈现多态性，而且D抗原也存在多种变异体，包括部分D、弱D和DEL型等[4]。弱D型具有正常D抗原所有表位，只是表达减弱，需要借助间接抗人球蛋白试验才能检出D抗原，且接受Rh阳性红细胞一般不产生抗-D抗体，但有研究发现，中国人常见的弱D15型能引起同种免疫反应产生抗-D抗体。部分D缺失，一部分D抗原表位，如经Rh阳性红细胞免疫后可针对缺失表位产生抗-D抗体[5-6]。正常Rh阳性个体单个红细胞膜表面D抗原分子数大于10 000个，一般D变异体分子数为70～4 000个，而DEL型红细胞表面的D抗原分子数小于30个，如果Rh阴性患者接受DEL型红细胞输注，在极罕见的情况下亦会免疫产生抗-D抗体[7]。虽有DEL型患者接受输血可产生抗-D抗体的个案报道[8]，但大量研究表明，DEL型患者输注Rh阳性血液产生同种免疫反应的可能性很小[9-10]；DEL型孕妇妊娠Rh阳性胎儿发生抗-D抗体同种免疫反应的可能很小，建议可免去定期的产前抗-D抗体检测和预防性Rh免疫球蛋白的使用。

D变异体形成的分子遗传机制决定了D抗原表达质和量的差异。弱D型个体携带正常RhD基因，但RhD mRNA的表达却大大降低，提示在转录水平或前体mRNA加工过程中有一定的缺陷。有研究发现，导致其抗原量减少的原因在于单个位点基因点突变发生在胞内区或跨膜区，导致D抗原数量减少，但一般对膜外抗原蛋白的空间构象不产生影响。部分D型形成的主要机制有2种：（1）RhD与RhCE基因重组，形成D-CE-D杂交基因，编码产物只获得D表位中的一部分，大多数部分D型由这种机制产生；（2）碱基突变，即在RhD基因中发生碱基突变。而DEL型形成有多种机制，包括错义突变、剪切位点突变、RhD基因缺失等。中国DEL型人群主要携带RhD1227A等位基因，该基因突变影响mRNA的拼接效率，极少mRNA能够加工成熟，致使RhD基因表达效率降低[7]。

本次调查从433份送检标本中共确认Rh阴性402例（92.8%，402/433），Rh阴性者在本地无偿献血人群中的比例为0.3%（402/154 392）；同时发现了23例D变异体（5.3%，23/433）和8例初检错误（1.9%，8/433）。在23例D变异体献血者中，与抗-D试剂（IgM）在盐水介质中完全无反应8例，在盐水介质中有凝集15例，但强度明显低于正常RhD阳性红细胞。

本次调查结果表明，Rh阴性献血者分型主要以dccee和dCcee为主。D变异体献血者分型以DvccEe最多，DvCcee和DvCcEe次之，DvCCee最少，未检出Dvccee。通过吸收放散试验，在402例Rh阴性献血者中检出DEL型105例（26.1%），与陆松松等[11]报道中国人群中DEL型占Rh阴性的20.0%～30.0%一致。本次共检出DelCcee、DelCCee和DelCcEe 3种DEL表型，均至少携带1个C抗原，符合谢俊杰等[7]提出的C抗原可作为初筛DEL型的1个重要标志的说法。但对于未携带C抗原的个体不能完全排除DEL型，如李宏等[12]研究发现了1例Delccee表型个体不携带C抗原。

抗-D抗体主要由Rh阴性个体接受输血或妊娠产生，可致溶血性输血反应和新生儿溶血病，在临床上有非常重要的意义。本次调查在23例D变异体和DEL型献血者血浆中均未检出不规则抗体，与周国平等[13]报道一致，他们在66例上海市D变异体献血者血浆中也未检出不规则抗体。本次调查虽未检出不规则抗体，但D变异体献血者血浆可能含有抗-D抗体，如果将含有抗-D抗体的血浆发往临床给Rh阳性患者输注，将导致严重输血反应。所以，作者建议，对于D变异体献血者必须进行不规则抗体的筛查。

针对D抗原表达的差异，不同类型D变异体个体接受输血的安全策略可能有所不同。大多数弱D型无D抗原表位的改变，因此，也没有产生同种抗-D抗体的危险，输注D抗原阳性的红细胞是安全的，弱D型母亲怀有D抗原阳性的胎儿时不需应用抗-D抗体免疫球蛋白预防。部分D型个体输入Rh阳性血或曾经生育过拥有正常D抗原的婴儿时可能产生抗-D抗体，而其可能产生导致严重溶血性输血反应或新生儿溶血病，所以，部分D型个体输血必须输注Rh阴性血液以避免产生抗-D抗体。对于DEL型个体输注Rh阳性血液是否发生同种免疫反应尚无定论，邵超鹏等[10]研究表明，DEL型不被D抗原刺激产生同种免疫反应，为开展DEL型个体临床输血观察提供了依据，如果大样本量研究和临床输血实践能够证实DEL型个体可以接受Rh阳性献血者血液，将有力保障Rh阴性血液的供应，减少宝贵的Rh阴性血液的浪费，避免因等待Rh阴性血液而延误治疗时机。

目前，临床常规的做法是将D变异体献血者所献血液视为Rh阳性血液对待，而D变异体受血者须输注Rh阴性血液。

总之，D变异体的准确鉴定和分类对指导临床输血及预防新生儿溶血病等具有重要意义，作者接下来将对本地区无偿献血者群体中D变异体形成的分子机制进行深入研究。

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本刊编辑部

Serological identification of D variants in volunteer blood donors in Nanchong region

Yang Song，Xiong Yijun，Zou Tao，Yang Xingming，Huang Wenyue
（Nanchong Red Cross Blood Center，Sichuan 637000，China）

ObjectiveTo study the serological phenotype of D variants in volunteer blood donors initially-diagnosed Rh negative in Nanchong region of Sichuan province.MethodsA total of 433 blood samples from 154 392 unrelated volunteer blood donors with Han nationality in Nanchong district of Sichuan province initially diagnosed as Rh negative were identified by indirect antiglobulin test for D variants，and the negative results were subsequently detected by absorption-elution testing for DEL type from indirect antiglobulin testing.In addition，all of the blood samples were screened and identified for irregular antibodies.ResultsAmong 433 samples，402 cases（92.8%，402/433）were confirmed Rh negative and 23 cases（5.3%，23/433）were detected D variants，including DvccEe for 8 cases（34.8%，8/23），DvCcee for 6 cases（26.1%，6/23）and DvCCee for 3 cases（13.0%，3/23）；A total of 3 DEL phenotypes for 105 cases were found，including DelCcee for 87 cases（82.9%，87/105），DelCCee for 16 cases（15.2%，16/105），and DelCcEe for 2 cases（1.9%，2/105），all of which were associated with C antigen；Furthermore，irregular antibodies failed to be detected in plasma samples of donors with D variants and DEL type.ConclusionIn the survey，serological phenotypes of D variant in volunteer blood donors initially-diagnosed Rh negative in Nanchong district of Sichuan province are learned，which has an important significance to guide the clinical blood transfusion and prevent hemolytic diseases of the newborns.

Blood donors；Serology；Sichuan；D variants；DEL type；Irregular antibody

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.013

：A

：1009-5519（2015）04-0517-03

2014-11-03）

杨松（1978-），男，四川泸州人，硕士研究生，主管检验师，主要从事血型血清学的研究；E-mail：46159390@qq.com。