赵雪强，蒋碧佳，银建华，唐碧芸，黄秀兰，李文翠

（桂林医学院附属医院临桂分院/临桂县人民医院，广西桂林541199）

ATO联合TRAIL对肺癌裸鼠移植瘤抑制作用及机制研究

赵雪强，蒋碧佳，银建华，唐碧芸，黄秀兰，李文翠

（桂林医学院附属医院临桂分院/临桂县人民医院，广西桂林541199）

目的探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合三氧化二砷（ATO）对裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用及其可能机制。方法将裸鼠肺癌移植瘤模型随机分为阴性对照组、TRAIL组、ATO低剂量组（ATO1组）、ATO高剂量组（ATO2组）、TRAIL联合ATO组，称取瘤质量并计算抑瘤率，采用免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）的表达。结果与阴性对照组比较，ATO1组、ATO2组对裸鼠肺癌移植瘤均具有抑制作用，TRAIL联合ATO组具有协同增效作用，并且上调Caspase-3的表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论ATO能增强TRAIL对裸鼠肺癌移植瘤的抑制作用，其机制可能与促进Caspase-3表达有关。

肺肿瘤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；三氧化二砷；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factorrelated apoptosis inducing ligand，TRAIL）是近年来发现的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族新成员，具有特异性杀伤肿瘤细胞而对机体正常组织不具有明显的不良反应[1]。但最近研究表明，大部分肺癌细胞对TRAIL耐药，TRAIL的耐药机制目前仍不十分清楚[2]。在体外发现三氧化二砷（arsenic trioxdio，ATO）不但可诱导肺癌细胞凋亡，还可增强肺癌细胞对TRAIL的敏感性[3]。但鉴于体外肺癌细胞培养环境与体内肺癌微环境的差异，本研究通过建立肺癌裸鼠移植瘤模型，采用TRAIL、ATO单药及联合用药对肺癌移植瘤的生物作用及可能机制进行研究，旨在为肺癌的临床治疗提供新的方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料人肺腺癌A549细胞为实验室自存。BALB/ c-nu裸鼠25只，雄性，6～8周，体质量16～24 g，购自桂林医学院科学实验中心动物室。杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM）购自GIBICO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，ATO购自哈尔滨伊达药业有限公司，TRAIL购自以色列PROSPEC公司，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）一抗、二抗购自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将A549细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，在恒温37℃、5%二氧化碳饱和湿度下培养，0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d传代1次。对数生长期的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后用培养基终止消化，然后，用磷酸盐缓冲液洗涤、离心、去上清液，收集细胞，调整细胞浓度为1×108mL-1的细胞悬液备用（台盼蓝染色确定所用细胞活力在95%以上）。

1.2.2 裸鼠移植瘤模型建立及实验分组在恒温（26～28℃）、恒湿（40%～60%）的无特定病源的（specificpathogen free，SPF）层流环境中饲养实验裸鼠。裸鼠食用的饲料及饮用水均经高压、高温灭菌。取上述细胞悬液接种于裸鼠右前腋窝部皮下，每只注射0.2 mL，接种后每天观察皮下移植瘤生长情况及接种点有无红肿、出血，接种后5 d开始成瘤，21 d左右明显成瘤，移植瘤模型建立。随机选择其中荷瘤成功的裸鼠20只，随机分为五组，每组4只。（1）阴性对照组：仅给予0.9%氯化钠溶液腹腔注射，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（2）TRAIL组：以50 μg/kg剂量腹腔注射给药，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（3）ATO低剂量组（ATO1组）：以1.5 mg/kg剂量腹腔注射给药，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（4）ATO高剂量组（ATO2组）：以3.0 mg/kg剂量腹腔注射给药，每次0.2 mL，每2天注射1次，共注射8次。（5）ATO联合TRAIL组：ATO以1.5 mg/kg剂量、TRAIL以50 μg/kg剂量腹腔注射给药，各取0.2mL，每2天注射1次，共注射8次。

1.2.3 测量药物作用后移植瘤质量及抑瘤率首次用药后第15天断颈处死全部裸鼠，手术完整取出肿瘤组织，剔除其他组织，称移植瘤质量。按公式计算肿瘤抑制率（%）=（1-干预组平均瘤质量/阴性对照组平均瘤质量）×100%。

1.2.4 病理组织学观察及免疫组化检测Caspase-3的表达用4%多聚甲醛固定取出的移植瘤标本，石蜡包埋连续切片，切片用苏木精-伊红染色（hematoxylin eosin，HE），显微镜下观察肿瘤组织形态学改变并拍照。将石蜡切片进行免疫组化检测，观察肿瘤细胞Caspase-3蛋白的表达情况。严格按照试剂盒提供的检测步骤进行操作，结果判定：以细胞质染为棕色至棕褐色为阳性细胞标记。每组随机选3个切片标本，显微镜下观察每张切片，随机选取5个高倍镜视野，分析阳性细胞光密度（optical density，OD）值，并计算各组Caspase-3蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理应用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；抑瘤率以百分比表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 裸鼠生长状况肿瘤细胞接种后裸鼠皮下移植瘤生长良好，21 d左右移植瘤直径平均达5 mm，成瘤率为100.00%。药物干预前裸鼠一般状态好；实验结束时20只裸鼠无一例死亡。经过每天密切观察发现，阴性对照组和TRAIL组裸鼠活动、进食明显减少，对外界反应迟缓；ATO1组、ATO2组、TRAIL联合ATO组祼鼠无明显惊恐、不安及拒食，均未发现排便异常、接种部位皮肤坏死等。

2.2 裸鼠体质量变化各组药物干预前裸鼠体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。药物干预后ATO1组、ATO2组、TRAIL联合ATO组裸鼠体质量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。阴性对照组及TRAIL组较ATO1组、ATO2组、TRAIL联合ATO组裸鼠体质量明显减轻，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.3 裸鼠移植瘤质量及抑瘤率观察药物干预后ATO1组、ATO2组、TRAIL联合ATO组裸鼠皮下移植瘤质量较阴性对照组、TRAIL组明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01），TRAIL联合ATO组更为明显，抑瘤率为80.60%，见表2。

表1 各组裸鼠药物干预前后体质量比较（±s，g）

表1 各组裸鼠药物干预前后体质量比较（±s，g）

注：与阴性对照组、TRAIL组干预后比较，aP＜0.05。

组别阴性对照组TRAIL组ATO1组ATO2组TRAIL联合ATO组n干预前干预后44444 17.72±1.15 19.39±2.13 18.92±1.77 18.47±1.52 18.98±2.42 16.00±1.66 17.61±1.44 20.02±2.17a19.18±2.21a20.09±2.56a

表2 各组裸鼠肿瘤质量及抑瘤率比较

2.4 移植瘤HE染色光镜观察TRAIL组移植瘤内肿瘤组织形态学无显著变化，随着ATO药物剂量的增加，肺癌组织减少，肺癌细胞数量也随之减少，并失去肺腺癌细胞的腺腔样结构的典型特征，且肿瘤组织出血、坏死增多，形状不规则，细胞核固缩变小，甚至核溶解，细胞结构消失，呈现空泡化改变；而ATO联合TRAIL组较ATO1组、ATO2组更为明显，见图1。

图1 肿瘤组织学检查（HE染色，400×）

2.5 移植瘤组织内Caspase-3蛋白表达情况与阴性对照组比较，TRAIL组Caspase-3表达无明显改变，随着ATO药物剂量的增加，Caspase-3表达阳性率增加，ATO联合TRAIL组明显上调Caspase-3的表达，与其他组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 Caspase-3蛋白的表达（免疫组化，400×）

2.6 Caspase-3蛋白阳性细胞OD值阴性对照组、TRAIL组、ATO1组、ATO2组，TRAIL联合ATO组Caspase-3蛋白阳性细胞OD值分别为0.204±0.014、0.225± 0.008、0.415±0.014、0.666±0.014和0.705±0.013。

3 讨论

TRAIL是近年来发现的TNF超家族成员，通过与其细胞表面受体[死亡受体4（death receptor 4，DR4）、死亡受体5（death receptor 5，DR5）]特异性结合从而诱导肿瘤细胞凋亡并且对机体正常组织无明显不良反应[1]。但最近研究发现，大部分肺癌细胞对TRAIL耐药，限制了TRAIL的临床应用[2，4-5]。TRAIL与ATO联用在体外克服肺癌耐药方面有效[3]。

有研究已发现，ATO具有抗肿瘤作用，但其作用是多途径、多靶点的复杂过程[6]。很多学者认为，ATO的主要抗肿瘤机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关[7-8]。ATO是通过降解融合蛋白、改变线粒体跨膜电位、通过转录因子影响细胞周期的转换、影响凋亡相关基因（如Caspase因子）等方法，从而诱导肿瘤细胞凋亡[9-10]。近年来，有文献报道，增加ATO剂量可逆转肺癌细胞耐药性[11]，但随着ATO剂量的增加，对正常细胞的不良反应也增大，从而影响了ATO在治疗肺癌方面的临床应用。目前，以ATO为基础的化疗组合成为研究热点。

本研究结果发现，ATO具有抗肺癌移植瘤的作用，并使肺癌细胞发生凋亡，甚至使肺癌组织发生坏死，增加ATO剂量可上调细胞质中Caspase-3的表达。TRAIL组瘤质量及抑瘤率与阴性对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明肺癌细胞对TRAIL耐药。TRAIL联合ATO组明显抑制裸鼠肺癌移植瘤生长，通过HE染色镜下观察细胞形态发现，ATO可增强TRAIL诱导肺癌细胞凋亡。

细胞凋亡主要是通过细胞内的线粒体通路和细胞外的DR通路启动细胞凋亡。线粒体通路主要是通过细胞内的促凋亡因子和抗凋亡因子相互作用调控诱导细胞凋亡，促凋亡因子（如B细胞淋巴瘤-白血病2蛋白家族成员）可使线粒体膜通透性发生改变，导致线粒体释放细胞色素C（cytocrhome C，Cyt-C）[12]，Cyt-C与凋亡蛋白酶活化因子（apoptotic proteaseactivating factor，Apaf-1）结合形成复合体并激活Caspase-9，解除凋亡抑制因子对Caspase-3的阻碍作用，激活Caspase-3发生生物效应，最终引起肿瘤细胞凋亡[13]；DR通路主要是当DR与死亡配体结合后传递凋亡信号，引起胞内Caspase-8的前体Procaspase在其末端的局部募集和串联结合，从而形成凋亡酶体（apoptosome），凋亡酶体形成后，其分子中的Procaspase通过自身水解而成为有活性的Caspase-8，活化的Caspase-8可引发下游的Caspase蛋白酶裂解多种蛋白质，如Caspase-3，然后激活下游效应酶，最终诱导大量肿瘤细胞凋亡[14]。而作为这2条凋亡通路上的下游共同基因——Caspase-3在细胞凋亡过程中具有至关重要的作用。所以，增加Caspase-3的表达就意味着可启动细胞内凋亡程序。本研究发现，增加ATO药物剂量Caspase-3的表达也相应增加，TRAIL联合ATO组明显上调Caspase-3的表达。因此，ATO可增强TRAIL对裸鼠肺癌移植瘤的抗肿瘤作用，其机制可能是通过促进Caspase-3的表达来实现的。

综上所述，TRAIL联合ATO可通过上调Caspase-3表达，提高肺癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，从而具有促进肺癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长的作用，为TRAIL和ATO二者配伍应用于临床提供了进一步的理论基础。

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Study on inhibitory action and mechanism of arsenic trioxide combined with TRAIL on transplanted human lung cancer in nude mice

Zhao Xueqiang，Jiang Bijia，Yin Jianhua，Tang Biyun，Huang Xiulan，Li Wencui
（The Lingui Branch of Affiliated Hospital of Guilin Medical College/Lingui County People′s Hospital，Guilin，Guangxi 541199，China）

ObjectiveTo approach the inhibitory action and proposed mechanism of TRAIL combined with ATO on transplanted human lung cancer in nude mice.MethodsThe nude mice bearing A549 lung cancer samples were randomly divided into the negative control group，group TRAIL，group ATO1，group ATO2 and TRAIL+ATO group.Tumor tissues were weighted and the inhibitory rate was observed.Immunohistochemistry was applied to detect the expression of Caspase-3 after treatments.ResultsCompared with the negative control group，it had a strong the obviously action inhibition on transplanted human lung cancer of nude mice in group ATO1 and group ATO2 while a synergistic effect in group TRAIL+ATO，and increased the expression of Caspase-3，whose difference had statistical significance（P＜0.05）.ConclusionATO may inhibit the growth of transplanted human lung cancer in nude mice through strengthening TRAIL，whose possible mechanism is potentially related to the expression of Caspase-3.

Lung Neoplasms；Caspase 3；Arsenic trioxide；Tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.04.002

：A

：1009-5519（2015）04-0485-03

2014-08-14

2014-09-25）

广西壮族自治区卫生厅立项课题（Z2013490）。

赵雪强（1981-），男，广西桂林人，硕士研究生，主治医师，主要从事肺癌基础与临床研究；E-mail：myzhaoxueqiang@126.com。