虞静芳

（苏州市吴江区第一人民医院，江苏 苏州 215200）

定量荧光PCR在肺炎支原体肺炎诊断中的应用

虞静芳

（苏州市吴江区第一人民医院，江苏 苏州 215200）

目的研究定量荧光PCR在支原体肺炎诊断中的价值。方法选取2012年1月至2012年12月938例肺炎住院患儿，进行定量荧光PCR、支原体抗体等多检查，明确MP感染。结果412（36.2%）例诊断为MP肺炎，278例患儿PCR阳性，高MP拷贝数的比例随着患儿的年龄增大而增大（P＜0.01），高MP拷贝数组的患儿发热率高于低MP拷贝数组（P＜0.01）；高MP拷贝数组的患儿喘息发生率高于低MP拷贝数组（P＜0.01）。高MP拷贝数组患儿血清学阳性率明显高于低MP拷贝数组（P＜0.01）。低MP拷贝数组的患儿混合感染率明显高于高MP拷贝数组（P＜0.01）。结论荧光定量PCR在MP肺炎的诊断中起重要的作用，高MP拷贝数更能提示MP的致病作用，而低MP拷贝数的临床意义可能不大。

定量荧光PCR；支原体肺炎

肺炎支原体（MP）是小儿时期感染性肺炎的重要病原之一[1]。临床常运用血清学检查MP抗体的方法诊断MP肺炎，然而该方法需间隔1～2周的双份血清MP-IgM测定[2]，一般用于回顾性研究。近年来，PCR被广泛用于MP感染的早期诊断，尤其对于婴幼儿或免疫力低下的患儿，PCR有更好的临床价值[3]。然而痰MP-PCR能出现假阳性，有研究发现支原体感染后患者痰PCR阳性最长可持续7个月，因此临床上区分支原体现症感染还是支原体携带存在困难。本研究使用定量荧光PCR探讨不同滴度PCR在MP肺炎诊断中的应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象：选取于2012年1月至2012年12月间因急性呼吸道感染而住我院儿科治疗的患儿938例，进行多种病原学检查，明确MP感染。

1.2 定量荧光PCR和病毒检测：所有患儿均于入院24 h内采集痰标本，用一次性吸痰管送入患儿鼻腔5～10 cm，利用负压吸取痰液1～2 mL，痰液标本经震荡、离心、去上清，加入裂解液提取DNA，再进行PCR扩增。此外，所有痰标本应用直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒-1、2、3和腺病毒抗原。

1.3 MP特异性抗体检测：本研究MP血清学抗体颗粒凝集法采用日本富士瑞必欧株式会社生产的赛乐迪亚一麦克Ⅱ试剂盒。本实验首份血清滴度≥1∶160为阳性；双份血清以MP 抗体滴度4倍及以上升高为确诊MP感染。

1.4 MP肺炎的诊断：因肺炎住院的患儿定量荧光PCR阳性或首份血清滴度≥1∶160为阳性或双份血清以MP抗体滴度4倍及以上升高均诊断为MP肺炎。

1.5 统计学分析：数据用SPSS18.0进行统计分析，各组阳性率比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。计量资料比较采用Wilcoxon秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MP定量PCR总检出情况

2.1.1 在938例因呼吸道感染而住院的患儿中，412（36.2%）例诊断为MP肺炎，其中98（8.6%）例为单纯PCR阳性诊断患儿，134（11.8%）例为单纯血清学诊断患儿，180（15.8%）例PCR及血清学均阳性。在这412例MP肺炎患儿中，214（51.9%）例男性，198（48.1%）例女性，平均年龄为37个月（极差，1～145个月）。

2.1.2 在412例MP肺炎患儿中，278（67.5%）例患儿PCR阳性，PCR检测范围为＜2500拷贝/毫升至＞2.5×107拷贝/毫升，我们将PCR拷贝数分为两组：高MP拷贝数组（＞10拷贝/毫升）（n=141）和低MP拷贝数组（＜106拷贝/毫升）（n=137）。高MP拷贝数的比例随着患儿的年龄增大而增大（P＜0.01）。

2.2 MP定量PCR月检出率分布情况：MP定量PCR阳性率在夏季（6～8月）达到高峰，且高MP拷贝数的检出率也在夏季检出率最高，1～3月高MP拷贝数人数为7例（13.5%），4～6月为32例（25.2%），7～9月为76例（49.6%），10～12月为26例（31.2%）。而低MP拷贝数组则无明显四季差异性。

2.3 不同拷贝数MP定量PCR的临床特点比较：MP定量PCR不同拷贝数的临床特点见表1。高MP拷贝数组的患儿年龄大于低MP拷贝数组[51±52）个月vs （26±29）个月，P＜0.01]；高MP拷贝数组的患儿发热率高于低MP拷贝数组（78.7% vs 58.7%，P＜0.01）；高MP拷贝数组的患儿喘息发生率高于低MP拷贝数组（15.8% vs 35.8%，P＜0.01）。

2.4 不同拷贝数MP定量PCR的血清学抗体比较：在这278例PCR阳性的MP肺炎患儿中，147例入院时血清学检测阳性，其中高MP拷贝数组有98例，低MP拷贝数组有49例，高MP拷贝数组患儿血清学阳性率明显高于低MP拷贝数组（P＜0.01）。入院时，高MP拷贝数组患儿血清学抗体几何平均滴度随年龄的增加呈递增趋势，而低MP拷贝数组随着年龄的增大变化不大。

2.5 不同拷贝数MP定量PCR的混合感染比较：在这278例PCR阳性的MP肺炎患儿中，176（63.3%）例患儿存在混合感染，即存在MP以外的其他病原学依据，98例合并病毒感染，78例合并细菌感染。低MP拷贝数组的患儿混合感染率明显高于高MP拷贝数组（28.1% vs 8.9%，P＜0.01）。

3 讨 论

MP感染主要引起呼吸系统疾病。MP经飞沫传染，潜伏期以及病程长，临床症状消失后仍可持续带病原体数月。MP首次感染后可存在于呼吸道上皮细胞内长达数月之久，可发展为无症状携带者[4]。

目前临床上应用最为广泛的检测方法是血清特异性抗体的检测，如颗粒凝集法，酶联免疫法等。由于MP-IgM于感染后7～10 d产生，因此在病程早期（如1周内）检测MP特异性抗体常会出现假阴性。而双份血清学检测虽能避免假阴性结果，但由于第2份血清采集时间长在第1次后的1～2周后，临床上广泛应用并不实际。此外，对于免疫系统发育未成熟及存在免疫缺陷的患儿MP-IgM的检测同样存在一定的局限性[5]。

表1 支原体定量PCR不同拷贝数的临床特点比较.

近年来随诊检验水平的提高，荧光PCR的应用，使临床医师能在早期诊断MP肺炎。我们的研究发现年龄越大，其感染MP时拷贝数越高，而在婴幼儿MP拷贝数则较低，拷贝数越高，越提示支原体感染，这与MP在学龄前期儿童及学龄期儿童的致病力较强一致。

在此次研究的278例PCR阳性的MP肺炎患儿中，147（52.9%）例血清学检测阳性。而在这147例血清学检测阳性的患儿中，多数患儿PCR为高MP拷贝数（98/147）；且在不同年龄段，高MP拷贝数患儿随着年龄的增长呈增长趋势。此外高MP拷贝数组的患儿混合感染率明显低于低MP拷贝数患儿（8.9%），说明高MP拷贝数提示MP在此次肺炎中的致病作用，而低MP拷贝数患儿血清学检测阴性率高，且常存在混合感染，提示低MP拷贝数可能在此次肺炎中的临床意义不大，应警惕MP污染或携带。

综上所述，荧光定量PCR在MP肺炎的诊断中起重要的作用，高MP拷贝数更能提示MP的致病作用，而低MP拷贝数的临床意义可能不大。

[1]Michelow IC,Olsen K,Lozano J,et al.Epidemiology and clinical characteristics of community-acquired pneumonia in hospitalized children[J].Pediatrics,2004,113(4):701-707.

[2]Bradley JS,Byington CL,Shah SS,et al.Executive summary:the management of community-acquired pneumonia in infants and children older than 3 months of age:clinical practice guidelines by the Pediatric Infectious Diseases Society and the Infectious Diseases Society of America[J].Clin Infect Dis,2011,53(7):617-630.

[3]Kim NH,Lee JA,Eun BW,et al.Comparison of polymerase chain reaction and the indirect particle agglutination antibody test for the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children during two outbreaks[J].Pediatr Infect Dis J,2007,26(10):897-903.

[4]Nilsson AC,Bjorkman P,Persson K.Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute Mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection[J]. BMC Microbiol,2008,8(1):93.

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R725；R563.1

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1671-8194（2015）05-0070-02