杨玉萍，李宜芸，李茜雯，王小菁

(华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广州510631)

紫锥菊属(Echinacea Moenc)是原产于北美洲的一种野生菊科花卉，该属有8个种及数个变种，已开发为药品者主要为紫锥菊E. purpurea(也称紫松果菊)、紫锥菊E. angustifoLia(松果菊)和白松果菊E. paLLia，均是多年生草本［1－2］.

紫锥菊(Echinacea purpurea)的主要特征是花托为圆锥形，具有管状花和舌状花，通常为玫瑰色或紫色，是美丽的观赏花卉，且具有较高的药用价值. 紫锥菊含有菊苣酸、羟基酰胺、多糖、倍半萜、多炔类、咖啡酸衍生物、黄酮等多种活性成分，用以治疗感染、关节炎、肺结核、气管炎、扁桃体炎、湿疹等［3－5］.菊苣酸是其重要的生理活性成分，具有抑制透明质酸酶的复制和抗HIV-1 的功效，还防止胶原质受自由基诱导而降解［4－5］. 紫锥菊的药理作用显著，在国际上受到普遍重视，作为一种免疫促进和调节剂，市场需求量大［6］. 而广州地区栽种的紫锥菊产量及其药用成分菊苣酸含量均高于原产地，适宜推广种植［7］.

20世纪末，我国成功引种紫锥菊［3］，主要采用传统种子育苗方式繁殖，但由于种子的采集困难，前期低温处理时间长［8］，萌发率低［3］，育苗有较大难度，难以实现规模化. 陈荣等［7］在广州地区引种紫锥菊的过程中，通过技术改良将种子萌发率提高到60%以上，直播时每穴播3 颗种子保证出苗整齐，但是采集种子困难、价格高仍是采用直播法大规模种植紫锥菊的限制因素. 以无菌幼苗的不同营养器官为外植体建立了高效的再生体系的报道［9－13］.以叶片和茎已成功诱导出不定芽［14－15］，但尚无报道以根、叶柄为外植体直接诱导出不定芽，建立更简单高效的紫锥菊再生体系对于开展其遗传转化工作十分必要.

本文以广州引种的紫锥菊不同营养器官(根、叶柄、叶片)为外植体，建立高效的再生体系，其中，以叶柄为外植体的不定芽诱导率高达94.8%.研究结果可为紫锥菊的快繁和遗传转化提供技术体系，也为从基因水平研究药用成分的合成途径并为品种的遗传改良奠定基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料

紫锥菊(E. purpurea)种子由华南农业大学生命科学学院吴鸿教授馈赠.

1.2 培养基成分与培养方法

1.2.1 播种 挑选饱满的种子并剥去外壳，先用体积分数为75%乙醇消毒30 ～45 s，体积分数为5%NaClO 消毒5 ～6 min，再用无菌水冲洗5 ～8 次. 消毒后用25 mg/L GA3溶液浸泡2 h 后接种于无菌水润湿的滤纸上，10 d 后将萌发的种子移至MS 培养基(pH 5.8)中. 培养室温度22±2 ℃，16 h 光/8 h 黑暗.

1.2.2 不定芽诱导 紫锥菊长至4 ～6 cm 时，将叶片切成0.5 cm×0.5 cm 小块，将根和叶柄切成长度约0.5 cm 小段，分别置于不同质量浓度NAA(0、0.5、1.0 mg/L)和6－BA(0、1.0、2.0 mg/L)配比的9 种MS 培养基中(表1)，筛选不定芽诱导最佳激素配比. 其中MS 为基本培养基，附加质量分数为3%蔗糖和0.8%琼脂，pH 5.8 ～6.2，配制分装后，于121 ℃灭菌20 min 后待用(下同). 每个培养皿(直径10 cm)接种20 ～30(叶片)或50 ～60(根、叶柄)个外植体，材料置于培养室培养，30 d 后统计诱导率. 诱导率=(分化出不定芽的外植体数/外植体总数)×100%. 平均出芽数=出芽总数/分化出不定芽的外植体数.

1.2.3 继代培养 将不定芽诱导培养基(MS +0.5 mg/L 6－BA)中叶柄上长出的新芽(高1 cm 左右)切下，转接到不同质量浓度NAA(0、0.2、0.5 mg/L)和6－BA(0.3、0.5、1.0 mg/L)配比的MS 培养基中(表2)，筛选继代培养最佳激素配比. 每瓶接种3株. 培养30 d 后统计增殖系数. 增殖系数=新生的植株数量/原来植株数量.

1.2.4 生根培养 将增殖培养基(MS +0.5 mg/L 6－BA)中获得的无根苗(3 cm 左右)切下，转到MS培养基和MS+0.5 mg/L NAA 培养基中，每瓶接种2 株. 培养30 d 后，统计生根率和根的数量，选择最适生根培养基. 生根率=生根苗数量/生根培养基中苗的总数)×100%.

1.2.5 炼苗与移栽 待苗长至5 ～7 cm 且具有发达的根时，逐渐拧松培养瓶的盖子进行炼苗，炼苗5 ～7 d后将苗取出，洗去附着在苗上的培养基，移栽到泥炭土及腐质土混合的基质中，用塑料盖罩住以保持湿度，5 d 后取出塑料盖. 每个处理移栽30 株，统计成活率. 成活率=(移栽成活的苗数量/移栽苗的总数)×100%. 成活后，可按常规进行栽培管理.

2 结果与分析

2.1 不定芽诱导

将叶柄、根分别切成0.5 cm 小段，叶片切成长度约0.5 cm×0.5 cm 小块，分别置于诱芽培养基上培养，3 d 后，切口处均膨大，1 周后，切口处开始出现愈伤组织. 结果(表1)表明，在9 种不同激素配比的培养基中，叶片外植体在培养基2.0 mg/L 6－BA 中，诱导率最高(73.7%)，平均出芽数为1.2(图1B);而在培养基0.5 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA中，平均出芽数最高(为1.8)，诱导率却仅有19.0%，在培养基2.0 mg/L 6－BA+0.2 mg/L NAA 中，诱导率为11.1%. 综合考虑诱导率和平均出芽数，叶片外植体的不定芽诱导最佳培养基是MS +2.0 mg/L 6－BA+3% 蔗糖+0.8% 琼脂.

在9 种不同激素配比的培养基中，根外植体在培养基0.5 mg/L 6－BA+0.2 mg/L NAA 中，诱导率最高(43.8%)，平均出芽数为1.9(图1C);而在培养基1.0 mg/L 6－BA+0.5 mg/L NAA 中，平均出芽数最高，达到2.6. 综合考虑诱导率和平均出芽数，根外植体的不定芽诱导最佳培养基是MS+0.5 mg/L 6－BA+0.2 mg/L NAA+3% 蔗糖+0.8% 琼脂.

在9 种不同激素配比的培养基中，叶柄外植体在培养基0.5 mg/L 6－ BA 中不定芽诱导率最高(94.8%)，平均出芽数为2.0(图1A)，最多可达6.0;而在培养基2.0 mg/L 6－BA +0.2 mg/L NAA中，诱导率最低(6.2%)，但可形成较多的不定芽.通过比较各处理可发现，当NAA 质量浓度一定时，随着6－BA 质量浓度的增加，诱导率呈下降趋势.综合考虑诱导率和平均出芽数，叶柄外植体的不定芽诱导最佳培养基是MS +0.5 mg/L 6－BA +3%蔗糖+0.8% 琼脂.

与叶片及根相比，以叶柄作为外植体诱导不定芽，可得到最高的诱导率及平均出芽数，为不定芽诱导适宜外植体.

2.2 继代培养

根据不定芽诱导实验结果(表1)，以叶柄为外植体，于培养基MS +0.5 mg/L 6－BA 中培养30 d可得到最多不定芽. 因此，将不定芽诱导培养基(MS+0.5 mg/L 6－BA)中叶柄上长出的新芽(高1 cm 左右)切下，转接到增殖培养基上培养，30 d 后统计新增芽的数目. 结果表明(表2)，仅含有6－BA(0.5 mg/L)的培养基上增殖系数大且新苗健壮，容易进行继代培养(图1D).

表1 植物生长调节剂对不同外植体不定芽分化的影响Table 1 Effects of different plant growth regulator combinations on the bud differentiation from three kinds of explants

表2 植物生长调节剂对叶柄再生苗增殖系数的影响Table 2 Effects of different plant growth regulator combinations on the bud proliferation coefficient

2.3 生根培养与炼苗

将增殖培养基(MS +0.5 mg/L 6－BA)中获得的无根苗(3 cm 左右)切下，转到MS 基本培养基和MS+0.5 mg/L NAA 培养基上生根培养. 在MS 培养基中，幼苗1 周后开始生根，30 d 时根的数目为5±2，长度可达10 cm，主根粗，颜色为黄绿色(图1E)，少数部分呈现紫红色;在MS +0.5 mg/L NAA培养基中，幼苗一周后开始生根，30 d 时根的数目为6 ±2，长度可达8 cm，没有主根，颜色呈现紫红色，少数为浅黄色. 以MS 基本培养基和MS +0.5 mg/L NAA 培养基为生根培养基的移栽存活率分别为93.3%、53.3%. 比较移栽存活率，MS 培养基更适宜紫锥菊幼苗后来的生根移栽. 移栽到泥炭土及腐质土混合的基质中，7 d 后长出新叶，28 d 后植株快速生长，再生苗生长健壮、叶片浓绿，3个月左右即可开花(图1F).

3 讨论

本研究以MS 培养基为基本培养基，探究NAA、6－BA 配比对紫锥菊不同外植体不定芽诱导和再生苗增殖的影响，结果表明叶柄、叶片及根均可快速诱导出正常不定芽，其中，外植体以生长20 ～30 d 的叶柄诱导效果最佳，不定芽诱导率可达94.8%，再生苗增殖系数为9.0，最适培养基均为MS +0.5 mg/L 6－BA. 据报道［9－15］，紫锥菊叶、根、茎均可作为外植体，不同器官作为外植体所需植物生长调节剂配比不同. 李标等［14］首次以紫锥菊叶片为外植体脱分化诱导愈伤组织，再分化形成再生植株，为紫锥菊的无性快繁提供了新途径.王伯初等［15］以紫锥菊茎和叶片为外植体，用IBA、NAA、GA 等多种植物生长调节剂诱导愈伤组织和不定芽分化，愈伤及不定芽诱导率均为90%左右.但是愈伤组织上分化出的芽容易发生变异，不容易保持母株的优良特性. Choffe等［13］以生长2个月的叶柄为外植体，利用BAP、TDZ、NAA 等植物生长调节剂建立再生体系，在NAA 单独存在时，诱导率仅为54.5%，同时添加多种植物生长调节剂(BAP、TDZ、NAA)才能使诱导率提高到80% ～90%. 本研究结果显示，叶柄作为外植体，在6－BA 条件下，不定芽诱导率达到94.8%，因此，与已有的研究相比，本研究建立的叶柄再生体系具有外植体(叶柄)材料多、诱导率高、周期短等优点，另外，所用植物生长调节剂仅为6－BA，配方简单，经济实惠，可为大规模繁殖中的种苗快繁提供新的技术体系，降低种植成本，提高经济效益，也为紫锥菊的转基因提供简单快捷的技术体系. 在本研究中，采用萌发20 ～30 d 的幼苗叶柄作为外植体.作者推测，这种幼嫩叶柄中含有更高的激素含量，为提高不定芽的诱导率奠定基础.

图1 紫锥菊再生体系Figure 1 Plant regeneration of E. Purpurea

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