谢博媛，李国明 ，刘 聪，严冠彦，黄克钧

(华南师范大学化学与环境学院，广州510006)

拉米夫定(LAMV)是新一代核苷类抗病毒药物，对于慢性乙型肝炎的治疗效果显著，具有明显抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的作用，使病人丙氨酸转氨酶(ALT)恢复正常，且伴有减轻肝组织坏死、炎症的作用，拉米夫定应答效果佳、价格低、安全性好，且最重要的是其耐药后治疗路径明确［1－2］. 海藻酸钠是一种阴离子聚电解质多糖，分子链上有大量的羧基，能与壳聚糖通过正、负电荷吸引形成复合凝胶，壳聚糖(CS)和海藻酸钠(SALG)为可降解聚电解质，生物相容性好，降解产物无毒［3－7］. 本文以CS 和SALG 为复合载体，以戊二醛(GD)为交联剂，合成以SALG 为载药内核，交联CS 为外层的拉米夫定缓释微球，探究不同因素对微球释药性能的影响.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

JSM-6510 型扫描电子显微镜(日本电子公司);2000 型激光粒度仪(英国Malvern 公司);IR Prestige-21 型红外光谱仪(日本Shimadzu 公司);Y2000型X 射线衍仪(丹东射线仪器有限公司);UV-2550型紫外－可见分光光度计(日本Shimadzu 公司);STA409PC 型热重分析仪(德国NETZSCH 公司);200PC 示差扫描量热仪DSC(德国NETZSCH 公司);KQ-500DB 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);D-2000ys 型数显电动搅拌器(天津市华兴科学仪器厂);

图1 为拉米夫定的化学结构，为湖北奥翔精细化工有限公司产品;壳聚糖(杭州富丽生物科技有限公司，脱乙酰度约为92%，粘均相对分子质量约为8 ×105);戊二醛(天津市大茂化学试剂厂，分析纯);透析袋(上海金穗生物科技有限公司);其他试剂均为国产分析纯.

图1 拉米夫定的结构Figure 1 Structure of lamivudine

1.2 实验方法

1.2.1 拉米夫定/壳聚糖微球(LAMV/CS)的制备采用反相乳液分散法制备微球，首先配制载药比为1∶5 的药物－壳聚糖醋酸溶液，将配好溶液加入油相(采用1∶5 的水油比、以Span-80 和硬脂酸镁为乳化剂)，高速搅拌0.5 h，形成稳定的乳液，按照1∶2的氨基－醛基物质的量比加入一定量的戊二醛，交联反应1 h 后，用1 mol/L 的NaOH 溶液调节pH 8，继续反应4 h. 停止反应，将乳液离心，用石油醚和乙醇洗涤数次，抽滤得出产物50 ℃下真空干燥得微球产物.

1.2.2 拉米夫定－海藻酸钠/壳聚糖微球(LAMVSALG/CS)的制备 根据正交试验设计，将海藻酸钠溶解在水中，配制10 mL 质量分数分别为2.5%、3.5%、4.5%的海藻酸钠溶液，按照m(lamivudine):m(SALG+CS)为1∶3、1∶5、1∶7 的药载比，配制成均一溶液，其中壳聚糖的浓度均为质量分数3.5%. 将上述溶液加入油相，高速搅拌0.5 h，形成稳定的乳液，滴加2 mL 质量分数为2%的CaCl2溶液反应0.5 h，缓慢滴加10 mL 质量分数为3.5%的CS 醋酸溶液，高速搅拌0.5 h，按照2∶1、1∶1、1∶2 的氨基－醛基比加入一定量的戊二醛，交联反应1 h 后，用1 mol/L 的NaOH 调节pH 至6、8、10，反应4 h 后停止反应，将乳液离心，用石油醚和乙醇洗涤数次，抽滤得出产物，50 ℃下真空干燥得微球产物.

1.2.3 拉米夫定标准曲线的测定 精确称取一定量的拉米夫定，分别以6 mol/L 的盐酸、pH 6.8 和7.4 的磷酸钠盐缓冲溶液，及pH 3.3 的柠檬酸－氢氧化钠－盐酸缓冲溶液为溶剂，配置成4、8、12、16、20、24 μg/mL 浓度梯度的标准溶液，在紫外－可见分光光度计中，以270 nm 为最佳吸收波长测定溶液的吸光度，拟合吸光度(A)和浓度(c)的相互关系线性回归曲线及方程.

1.2.4 微球的包封率及载药量的测定 精确称取3 mg 微球于10 mL 6 mol/L 的HCl 溶液中，超声分散0.5 h，溶胀6 h，静置至澄清后，取出5 mL 上清液，紧接补充5 mL 6 mol/L 的HCl 溶液，重复3 次上述实验，使得药物完全释放出来，将清液定容并在最佳吸收波长测定其吸光度，代入回归方程计算其浓度，按照以下公式求得微球的包封率和载药量分别为70.3%和11.6%，

1.2.5 微球粒径分布 取少量微球，置于水中，超声分散，以激光粒度仪测量其粒径.

1.2.6 红外光谱分析 以溴化钾为背景，将样品研磨压片，在4 000 ～400 cm－1范围内进行扫描.

1.2.7 X 射线衍射光谱的分析 靶材选用Cu Ka，λ =0.154 056 nm，电压35 kV，电流25 mA，扫描速率0.02°/s，5°≤2θ≤50°.

1.2.8 体外释放 精确称取0.05g 微球置于透析袋中密封，分别置于50 mL pH 6.8 和7.4 的磷酸钠盐缓冲溶液、pH 3.3 的柠檬酸－氢氧化钠－盐酸缓冲溶液的释放介质中，在(37 ±0.5)℃，以固定速率振荡，定时取释放介质5 mL(同时补充等量同温的释放液)，测定吸光度，计算药物浓度，并绘制累积释药率随时间的变化曲线.

2 结果与讨论

2.1 拉米夫定的分解温度与热稳定性

由拉米夫定的差示扫描量热(DSC)分析曲线(图2)看出，在约176 ℃处有LAMV 的吸热熔融峰，在约270 ℃处，LAMV 受热分解放出热量;由TG 和DSC 曲线可知，拉米夫定的分解温度约为270 ℃.表明拉米夫定的热稳定较好，整个实验过程中，反应温度不会使LAMV 的结构发生变化.

图2 拉米夫定的TG 和DSC 曲线Figure 2 TG/DSC curves of laminvudine

2.2 LAMV/CS 和LAMV-SALG/CS 微球的理化性能

2.2.1 微球包封率和载药量的比较 由表1 可知，拉米夫定－ 海藻酸钠/壳聚糖微球(LAMV-SALG/CS)的包封率和载药量高于壳聚糖微球，因为拉米夫定和海藻酸钠作为微球内核时，静电结合形成弱盐键，较多的药物被包覆在微球内部，避免戊二醛的醛基和拉米夫定的氨基直接结合，让药物被固定在交联网络中.

表1 不同微球的包封率和载药量Table 1 Encapsulation efficiency and loading efficiency of different microspheres %

2.2.2 微球的形貌及粒径分布 图3 显示不同组成的拉米夫定缓释微球(LAMV/CS)的扫描电子显微镜图片，其中图3A、B 为拉米夫定/壳聚糖微球，经扫描电镜放大2 500 倍和10 000 倍，微球粒径约为2 μm，小部分粘连，经激光粒度仪测得微球平均粒径为10 μm. 图3C、D 拉米夫定－海藻酸钠/壳聚糖微球(LAMV-SALG/CS)，经扫描电镜放大1 000倍和5 000 倍照片如图3C、D. 高交联度使制得微球分散性好，较少粘连［8］. 激光粒度仪测定粒径分布如图4，测得平均粒径为6 μm，部分微球的粒径约为200 nm，与电镜图片相符，粒径分布数据大于电镜观测值，这是小部分微球团聚所造成的. 测得微球载药量为11.6%，药物包封率达70.3%.

图3 微球的扫描电镜图Figure 3 SEM of microspheres

图4 微球的粒径分布Figure 4 Particle diameter distribution of the microspheres

2.2.3 红外分析 图5 为CS 的红外吸收光谱图(图5)，1 603 cm－1为—NH2变形振动吸收峰;图谱b 为SALG 的红外吸收光谱图，1 611 cm－1和1 415 cm－1为COO－的对称和反对称伸缩振动峰;图谱c为拉米夫定/壳聚糖微球的红外光谱图，1 653 cm－1处表明—NH2和HC O 的结合生成的HC N，—NH2变形振动吸收峰由1 602 cm－1偏移到1 570 cm－1，且在2 920 cm－1和2 855 cm－1的C—H 伸缩振动峰明显变强，说明壳聚糖与戊二醛形成了交联网络;图谱d 为LAMV-SALG/CS 复合微球的红外吸收光谱图，由图谱的对比分析可知，海藻酸钠中的COO－对称伸缩振动峰由1 611 cm－1向低波数移动17 cm－1，药物中的—NH2面内弯曲振动峰1 619 cm－1消失，表明海藻酸钠与药物发生静电结合作用. 1 659 cm－1为—NH2和—HC O 的结合生成的HC N，图谱d 海藻酸钠和壳聚糖的特征吸收峰明显，证明海藻酸钠存在于微球内部，壳聚糖和戊二醛形成交联网络，图谱d 出现药物在1 505 cm－1的吸收峰，强度明显减弱，证明药物已被包覆在微球内部［9－11］.

图5 不同样品的红外光谱Figure 5 IR spectra of different samples

2.2.4 XRD 分析 图6 为拉米夫定、空白壳聚糖微球、药物复合微球的XRD 衍射图谱. 拉米夫定的衍射峰在药物复合微球中明显出现，但强度降低，原因是在整个微球制备过程中，药物与海藻酸钠良好作用，使药物以单分子形式均匀分布在海藻酸钠载体中，不会聚集成结晶体，说明了在微球中有拉米夫定存在，其主要以单分子形式存在［12］.

图6 不同样品的XRD 谱Figure 6 XRD patterns of samples

2.3 微球释药性能的影响因素

2.3.1 不同pH 的释药介质 图7 为微球在不同pH 条件下的体外模拟释药曲线，由a 线可知，释药累积率为27%的释药时间长达82 h，缓释性能较好.在酸性缓冲溶液释药介质中，微球的释药速率比在弱碱性介质中快. 在酸性介质中，CS 链节舒展，溶胀程度大，致使药物从交联网络中释放出来的速率快. 而在弱碱性介质中，CS 交联网络处卷缩状态，增大了药物向外部扩散的阻力，导致药物释放减慢.

图7 在不同的pH 条件下拉米夫定－海藻酸钠/壳聚糖微球的释放曲线Figure 7 Drug-releasing curves of LAMV-SALG/CS microspheres in different pH media

2.3.2 海藻酸钠浓度 在壳聚糖溶液质量浓度为3.5%，药载比为1∶5，其他反应条件相同情况下，改变海藻酸钠浓度制备的微球，在pH 6.8 的磷酸钠盐缓冲溶液中的体外模拟释药情况如图8. 随着海藻酸钠浓度的增大，释药速率降低. 药物和海藻酸钠溶液在高速分散后形成交联的内核，由于内核海藻酸钠的浓度增大，增大分子链的堆积密度，以及相同浓度的壳聚糖和较高浓度的海藻酸钠结合程度更大，交联层更厚，使得药物扩散至外界的阻力增大，释药速率减缓［13］.

图8 不同质量分数海藻酸钠制得的微球在pH 6.8 的磷酸盐溶液中的释放曲线Figure 8 Drug-releasing curves of microspheres with different SALG concentrations in pH 6.8 phosphate solution

2.3.3 交联反应时的pH 在壳聚糖质量浓度为3.5%，海藻酸钠质量浓度为3.5%，载药比为1∶5，改变交联pH，制备的复合微球，在弱酸介质中的释药情况如图9. 交联时的pH 为碱性时，所得微球的药物释放速率较快，而pH 6 和pH 8 的释药速率慢且相近. 在碱性条件下，CS 处于卷缩状态不利于交联，不利于活性基团的接触，使得交联度不高，所以药物在释放过程中阻力小，释药速率快［14］.

图9 不同交联pH 制备得微球的释药曲线Figure 9 Drug-releasing curves of the microspheres corsslinked in different pHs

3 结论

采用反相乳液分散－化学键合法，海藻酸钠溶液质量分数为2.5%，壳聚糖溶液质量浓度为3.5%，药载比为1 ∶5，反应时调节pH 8，温度为55 ℃，反应4 h，制备得LAMV-SALG/CS 复合微球，形貌完整均匀，其药物包封率为70.3%，载药量为11.6%，性能指标明显优于同样条件下制备的LAMV/CS 微球. LAMV-SALG/CS 复合微球释药率为27%时释药周期为82 h. 体外模拟释放曲线显示药物释放速率平缓而稳定，表现出良好的药物缓释性能.

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