唐媛媛，莫绪维，陈 鹤，李 群，蔡亦红，沈继龙

(1.安徽医科大学基础医学院病原与免疫学实验室，安徽合肥 230032;2.安徽省六安市人民医院检验科，安徽六安 237000;3.安徽医科大学第一附属医院检验科，安徽合肥 230022;4.安徽医科大学公共卫生学院卫生检验检疫系，安徽合肥 230032;5.安徽医科大学基础医学院寄生虫学教研室，安徽合肥 230032)

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)隶属于顶复门，是一种专性细胞内寄生原虫，可寄生在几乎所有有核细胞中，可引起人兽共患弓形虫病，对人类健康和畜牧业造成严重的危害。全世界约有1/3人感染弓形虫病，我国的人群感染率为10%。在弓形虫入侵过程中，微线体首先释放出微线体蛋白，微线体蛋白的释放会立刻触发棒状体分泌RONs［1］。棒状体蛋白由虫体前端的分泌器官ROP分泌，在虫体入侵及纳虫空泡的形成过程中起重要的作用。大多数棒状体蛋白(ROPs)定位在纳虫空泡(parasitophorous vacuole，PV)和纳虫空泡膜(parasitophorous vacuole membrane，PVM)上，是弓形虫入侵宿主细胞以及在宿主细胞中生存的必要条件［2］;同时作为一种重要的毒力因子在和宿主细胞的相互作用中也起到非常重要的作用。目前研究较多的为ROP1和ROP2，其中属于ROP2家族的ROP2、ROP16、ROP18 具有良好的免疫原性和保护性［3－4］。在侵入宿主细胞后，ROP16会移位到宿主细胞核中，影响宿主细胞的信号转导(可能参与转录相关因子STAT3和STAT6的调节［5］。Murray等在研究中发现，Type I型弓形虫是通过ROP16蛋白直接磷酸化STAT3/STAT6诱导巨噬细胞向M2型极化;而TypeⅡ型弓形虫ROP16由于其氨基酸序列的503位点由亮氨酸突变为丝氨酸(ROP16 L503S)而使得其无法有效活化STAT3/STAT6［6］。结合这些研究成果，本实验对流行于我国的优势基因型Chinese1基因型弓形虫(Wh3株)ROP16进行研究，以期为我国优势基因型弓形虫株的研究、弓形虫主要抗原［7］及弓形虫病疫苗的研究奠定基础［8］。

1 材料与方法

1.1 材料 实验小鼠为SPF级BALB/C小鼠购于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司［动物许可证号:SCXK(苏)2014－0007］，6～8周，雌性，体重28～30 g，室温下自由进食标准颗粒饲料、卫生饮水;Chinese1基因型弓形虫(Wh3株)株，大肠杆菌XL1-blue、BL21 和 DH5α，原核表达载体 pET-28a，真核表达载体pEGFP-C2，293T细胞均由本实验室保种;引物由上海生物工程有限公司合成;TagDNA聚合酶，高保真PCR酶、dNTP、一步法RT-PCR试剂盒(Roche公司)，限制性内切酶 NOT1、ECOR1，Kpn 1，pMD18-T，T4连接酶，PCR产物纯化试剂盒，胶回收试剂盒均购自大连宝生物(TATARA)公司;小量质粒提取试剂盒购于美国OMEGA公司;HRP标记抗小鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司;其它试剂系国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 弓形虫速殖子DNA的提取 弓形虫速殖子感染健康小鼠，待小鼠出现明显的弓背、竖毛、活动减少等症状时脱颈处死小鼠，从小鼠腹水中收集弓形虫速殖子，PBS洗涤后计数，根据虫体数量加入Trizol裂解虫体，提取虫体总RNA，然后经过逆转录合成cDNA，－80℃冻存备用。

1.2.2 弓形虫ROP16基因的体外扩增和克隆 参照PUBMED上搜索到的RH株的ROP16基因序列，设计原核表达质粒引物:上游引物:5'-gaattcatgaaagtgaccacgaaag-3'，下游引物:5'-gcggccgcctacatccgatgtgaagaaagtt-3';按照pEGFP-C2载体引物设计要求，设计真核表达质粒引物:上游引物:5'-gaattcatgaaagtgaccacgaaag-3'，下游引物:5'-gggtacccctacatccgatgtgaagaaagtt-3'。以弓形虫基因组DNA为模板，扩增弓形虫ROP16基因，反应条件为:预变性2 min，94℃变性30 sec，64℃退火 30 sec，72℃延伸 2 min 30 s，35个循环;1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，胶回收试剂盒回收PCR产物，与pMD18-T连接，后转化大肠杆菌XL1-blue感受态细胞，菌落经PCR和质粒DNA序列分析鉴定阳性菌株。

1.2.3 原核表达重组质粒的构建与鉴定 抽提含正确的插入片段的pMD-T质粒和质粒pET-28a质粒，分别用NOT1、ECOR1进行双酶切，将酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的载体和目的片段进行连接，转化大肠杆菌BL21，菌落经PCR和双酶切鉴定。

1.2.4 ROP16基因在大肠埃希菌BL21中的诱导表达 将鉴定正确的重组质粒pET-28a/ROP16单菌落接种于含卡那霉素的LB培养基培养过夜，次日取200 μL于20 mL培养基中继续培养，当A600值在0.4左右时加入IPTG至终浓度为1 mmol·L－1，继续培养6 h，后每隔1 h离心收集菌液，超声波处理，高速离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析。

1.2.5 重组蛋白的免疫反应性分析 重组阳性菌pET-28a-ROP16和空载体pET-28a转化菌裂解物经SDS-PAGE电泳后转至NC膜，于37℃用BSA封闭2 h，以鼠抗弓形虫血清(1∶50稀释)为一抗，HRP标记抗小鼠IgG作二抗，进行Western blot，分析重组蛋白免疫反应性。

1.2.6 真核表达重组质粒的构建与鉴定 抽提含有正确插入片段的pMD18-T的质粒和 pEGFP-C2质粒分别用NOT1、Kpn 1进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分离酶切后的目的片段和载体，胶回收试剂盒回收酶切产物，将酶切后的目的片段和载体进行连接，转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞，菌落经PCR和双酶切鉴定。

1.2.7 真核表达质粒在293T细胞中的表达 采用贴壁细胞的DNA转染法，按脂质体LipofectamineTM3000的使用说明进行。在转染前一天将293T细胞转入6孔板中培养，待细胞长至细胞瓶底70%～80%饱和度且细胞状态良好是进行转染。在无菌的1.5 mL离心管中准备下列溶液:溶液A:用无血清DMEM将4 μg待转染质粒DNA稀释成250 μL;溶液B:用无血清DMEM将6 μL脂质体 LipofectamineTM3000稀释至250 μL;合并溶液 A和溶液B，轻轻混匀，室温孵育20 min，以形成脂质体-DNA复合物;将待转染的细胞换液，用无血清的DMEM洗涤两次;向混合液中加入1 mL 37℃预热的无血清DMEM，轻轻混匀，缓慢加入待转染细胞中;置CO2培养箱中，37℃孵育6 h后弃细胞上清，加入含10%小牛血清的DMEM细胞生长液，置CO2培养箱中继续培养24 h;置倒置荧光显微镜下观察拍照。

1.2.8 RT-PCR法鉴定蛋白在细胞中的表达 将转染质粒24 h后的细胞用(PBS)洗涤两次之后，用Trizol裂解细胞，提取细胞RNA，逆转录合成cDNA。以cDNA为模板进行PCR扩增;扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.9 生物信息学分析 蛋白质生物学功能的发挥在很大程度上取决于其三维结构，预测蛋白的三维结构对于蛋白质的结构分析及其功能预测都有很好的支持作用;本实验采用能够同源建模和从头合成两套不同算法I-TASSER预测ROP16基因的3D结构，为进一步研究ROP16的结构和功能提供科学资料［7］。

2 结果

2.1 原核表达载体的双酶切鉴定 重组阳性菌pET-28a-ROP16经 NOT1、ECOR1双酶切，获得约5.3 kb和2.1 kb两条带，大小与载体片段和目的DNA长度相符(图1)。

2.2 目的基因测序结果 经上海生工测序TgCtwh3的ROP16基因序列扩增出2124 bp片段，与RH株ROP16基因序列99%同源;经比对氨基酸序列503位点与RH株的ROP16序列503位点同为亮氨酸(图2)。

2.3 原核表达质粒在大肠埃希菌BL21中的表达将各小时留取的IPTG诱导表达的菌体超声波破碎后进行SDS-PAGE电泳，在约77 kDa处有明显条带，重组蛋白分子质量大小与预期一致。随着诱导时间的延长，融合蛋白的表达量逐渐增加，在37℃1 mmol·L－1IPTG诱导6 h表达量最高(图3)。

2.4 原核表达产物的Western blot鉴定 Western blot结果显示，重组的pET-28a-ROP16蛋白能被鼠抗弓形虫免疫血清识别，在77 kDa处可见一条识别条带(图4)。

2.5 真核表达质粒在293T细胞中的表达 荧光倒置显微镜下观察，可见细胞成功转染进293T细胞中，说明所构建的真核表达质粒在293T细胞中成功表达(图5)。

2.6 RT-PCR法鉴定蛋白在细胞中的表达 用转有pEGFP-C2-ROP16重组质粒、pEGFP-C2空质粒的293T细胞的总RNA作为模板分别进行RT-PCR扩增，只有转染有pEGFP-C2-ROP16质粒的可以扩增出约2 100 bp条带，与ROP16基因片段大小相符(图6)。

2.7 蛋白质的3D结构图 图中白色“箭头”标注的为503位点(图7)。

3 讨论

近些年来通过不同基因型虫株杂交、基因敲除和转基因弓形虫虫株实验证实弓形虫具有某些特定的毒力因子在诱导活化巨噬细胞、刺激宿主免疫反应上起关键作用［9］。目前已经确定的毒力相关因子包括弓形虫表面抗原(surface antigen，SAG)1、ROP5、ROP16、ROP18、致密颗粒蛋白(dense granule protein，GRA)7、GRA15等。其中 ROP16蛋白是一种具有多态性的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，同时具有酪氨酸激酶活性;在弓形虫侵入宿主细胞的过程中由棒状体释放进入胞质，然后迅速进入胞核，能够直接磷酸化STAT3的Tyr705和STAT6的Tyr641残基［10－11］。如前所述，Type I型(RH 株)弓形虫是通过ROP16直接磷酸化STAT3/STAT6诱导巨噬细胞向M2型极化;而Type II型弓形虫ROP16氨基酸序列的503位点由亮氨酸突变为丝氨酸(ROP16 L503S)而使得其无法有效活化STAT3/STAT6，可见ROP16蛋白在弓形虫的入侵以及寄生的过程中起到非常重要的作用。Wh3株属于Chinese1型弓形虫，是中国优势基因型弓形虫株，其毒力与RH株相似。小鼠梯度毒力实验证实(资料为本实验室所有)，接种同样剂量的速殖子小鼠Wh3株可引起小鼠的死亡时间略迟于RH株，100个速殖子均可以导致小鼠100%死亡。

本实验通过RT-PCR扩增出我们国家Wh3分离株的 ROP16蛋白，经测序发现 WH3分离株ROP16蛋白序列503位点处为亮氨酸，那么由此猜测，我国的WH3分离株也可以直接磷酸化STAT3/STAT6，对巨噬细胞的偏移应答起到一定的调控作用;其次本实验应用RT-PCR扩增TgCtwh3-ROP16基因片段，插入原核载体pET-28a的多克隆位点，经双酶切、PCR、测序鉴定确认，成功构建重组质粒pET-28a/ROP16，并在大肠埃希菌BL 21中高效表达，该重组蛋白以可溶的形式存在于超声裂解的菌液的上清中，Western blot显示该蛋白能被鼠抗弓形虫血清所识别，表明其具有免疫原性;再次本实验构建的真核表达质粒，利用增强型绿色蛋白(EGFP)报告基因，产生的荧光较普通绿色荧光蛋白强35倍，大大增强了报告基因的敏感度［12］;本实验结果发现该重组质粒能够成功的在293T细胞中表达并通过RT-PCR鉴定结果正确，但是转染效率不高，约30%左右，分析可能与ROP16基因片段过大、ROP16蛋白本身属于毒力因子不利于转染以及转染试剂的选择有关;接下来会尝试选择其他转染试剂以及构建病毒包装质粒来进行转染。所述，本实验成功构建了我国优势基因型WH3株的棒状体ROP16蛋白的原核及真核重组表达质粒，为我国优势基因型弓形虫株的免疫特性、致病机制以及为我国的弓形虫疫苗的研究打下了一定的基础;其次成功构建ROP16基因的3D结构对于进一步深入的生物信息学分析以及蛋白的功能研究具有一定的导向意义［13］。

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