陈肖东，苏 峰，毕东辉，桂双英，何广卫

(1.安徽中医药大学，安徽合肥 230031;2.合肥医工医药有限公司，安徽合肥 230088)

癫痫是一种中枢神经系统疾病，是由大脑神经细胞异常放电导致的突发性、反复性和短暂性的大脑功能失调。世界卫生组织 (WHO)估计全世界大约有5 000多万患者，我国癫痫发病率约为1‰，患病率约为5‰［1］。癫痫的反复发作对家庭和社会都造成极大的负担和危害。

双丙戊酸钠(Divalproex Sodium)是目前抗癫痫治疗的一线药物。药效学研究发现它对各种癫痫的实验模型 (全身性和部分性)均有抗惊厥作用。对人的各种类型癫痫发作有抑制作用。其主要的作用机制可能是抑制了γ-氨基丁酸 (GABA)降解过程中GABA转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶活性，从而使脑内GABA含量增高所致［2］。与丙戊酸钠相比，双丙戊酸钠由于胃肠道副反应更轻、毒性更小、药物相互作用较少，已取代了传统丙戊酸钠的市场地位［3］。双丙戊酸钠肠溶片治疗癫痫每日用量600 ～1 200 mg，服用2～3次，服药频率较高，导致患者依从性较差。目前国外已有双丙戊酸钠缓释片上市，国内还鲜有报道。

国内制剂工艺优化和处方筛选常用均匀设计和正交设计，但该两种方法实验精度不够，建立的数学模型预测性较差。采用固定其他因素改变某一因素的单因素考察法能收到一定效果，但条件优选凭经验，且无法考察各因素间的相互作用［4］。Plackett-Burman试验设计常用于考察多个因素对结果的影响，优选主要影响因素;星点设计具有试验次数少、精度高等特点，常结合效应面法优化考察因素。目前三者联合应用较成熟［5－9］，可以为制剂处方筛选提供依据。

本文用美国雅培公司 (Abbott)生产的双丙戊酸钠缓释片 (商品名:Depakote®)为参比制剂，基于Plackett-Burman试验优选的主要影响因素，采用星点设计—效应面法优选双丙戊酸钠缓释片处方，制成每天给药一次的双丙戊酸钠缓释片(每片250 mg)，避免普通制剂服用后，血药浓度的波峰波谷现象，同时减少服药次数，方便临床用药，为骨架缓释片的处方筛选提供新思路。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 ZRS-8G智能溶出仪 (天津市天大天发科技有限公司);安捷伦8453紫外分光光度计 (安捷伦科技有限公司);岛津LC-15C高效液相色谱仪、SPD-15C紫外检测器及LCsolution Lite色谱工作站(岛津制作所);ZDY-8重型单冲压片机(上海远东制药机械总厂);Delta 320pH计 (Mettler-Toledo仪器有限公司);XS105分析天平(Mettler-Toledo仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂 双丙戊酸钠原料药 (合肥医工医药有限公司，含量99.37%，批号20130601);双丙戊酸钠缓释片 (美国雅培公司，批号:1015725);HPMC K100M、HPMC K15M(上海卡乐康包衣技术有限公司);乳糖 (安徽山河药用辅料股份有限公司);微晶纤维素 (安徽山河药用辅料股份有限公司);PEG6000(天津天成制药);盐酸(上海振企化学试剂有限公司);氢氧化钠 (天津星马克科技有限公司);乙腈(百灵威科技有限公司，色谱纯);甲醇(百灵威科技有限公司，色谱纯)。

2 实验方法

2.1 释放度分析方法的建立 按照美国食品药品监督管理局 (Food and Drug Administration，FDA)官方网站上公布的“固体制剂溶出曲线数据库”关于原研制剂双丙戊酸钠缓释片的溶出方法，同时依据国家食品药品监督管理总局药品审评中心关于仿制药体外溶出实验相关指导原则，本次研究选择FDA推荐的pH 5.5的磷酸盐缓冲溶液作为本品释放度测定的标准介质，体积为900 mL，转速为100 r·min－1。

2.1.1 检测波长的选择 取双丙戊酸钠对照品适量，用标准介质溶解并定量稀释成每1 mL中约含双丙戊酸钠10 μg的溶液，照紫外—可见分光光度法(中国药典2010年版二部附录IV A)，在200～400 nm波长范围内扫描。

2.1.2 标准曲线的建立 精密称定双丙戊酸钠对照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加标准介质溶解至刻度，得浓度为1 g·L－1的贮备液。精密量取5 mL贮备液至100 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，再分别精密量取上述溶液 1、2、3、5、10、25 mL 于100 mL容量瓶中，用标准介质稀释到刻度，以标准介质为空白，照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定，以峰面积对浓度进行线性回归。

2.1.3 精密度及中间精密度试验 取双丙戊酸钠缓释片剂细粉适量，精密称定，加标准介质稀释成每1 mL约含双丙戊酸钠0.2 mg的溶液，重复进样6次，考察方法的精密度，同时在此操作条件下，分别由不同实验人员在不同天进行测定，考察方法的中间精密度。

2.1.4 稳定性试验 取双丙戊酸钠片剂细粉适量，精密称定，加入标准介质溶解并稀释成每1 mL含双丙戊酸钠0.2 mg的溶液，分别于0、2、4、6 和8 h测定，考察样品溶液的稳定性。

2.1.5 回收率试验 按处方量的80%、100%、120%分别精密称取双丙戊酸钠对照品，按处方比例加入辅料混匀，置200 mL容量瓶中，加入标准介质并稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1 mL置50 mL容量瓶中，用标准介质稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，进高效液相色谱仪并计算回收率，记录峰面积，计算回收率。

2.2 双丙戊酸钠缓释片的制备 将双丙戊酸钠原料过100目筛与HPMC K100M、HPMC K15M、乳糖、PEG6000充分混合，以乙醇作为润湿剂制软材，20目筛制粒、烘干、20目筛整粒，混合均匀后压片，片重约650 mg。

2.3 Plackett-Burman实验设计筛选主要影响因素 Plackett-Burman试验设计是一种两水平的析因设计，可从较多因素中筛选出少数重要因素。每个因素取两水平，通过比较两水平之间的差异性来确定因子的显著性，对于N次实验至多可研究N－1个因子，但实际因子应该不多于N－4个，保留3个以上虚拟变量用以估计试验误差。

因素及水平范围:根据预实验结果选用HPMC K100M和HPMC K15M作为缓释片的骨架材料，微晶纤维素和乳糖作为填充剂，乙醇作为润湿剂，PEG6000作为润滑剂，选取7个实验因素(A:HPMC K15M用量、B:HPMC K100M用量、C:微晶纤维素的用量、D:乳糖用量、E:乙醇浓度、F:干燥时间、G:硬度)和 4个空白因素 (H、I、J、K)，合计 12 次实验［4］。根据预实验结果确定每个因素高、低两个水平。用Design-expert 8.0软件设计实验并进行数据处理。Plackett-Burman实验设计因素及水平见表1。

表1 Plackett-Burman设计的因素与水平

2.4 星点设计—效应面法优化处方 双丙戊酸钠缓释片的规格是每片250 mg，主药占40%。Plackett-Burman试验表明HPMC K100M和HPMC K15M的量和润湿剂乙醇的浓度是影响片剂释放的主要因素。

根据 Plackett-Burman实验设计结果，采用HPMC K100M 用量(X1，mg)、HPMC K15M 用量(X2，mg)和乙醇浓度(X3，%)作为考察因素，查询FDA规定HPMC K100M和HPMC K15M作为口服缓释片处方最高用量分别为320 mg和80.25 mg，作为骨架材料的常规用量为不低于片重的25%。故其范围为:X1:162.5～320 mg;X2:0 ～80.25 mg;X3:10%～90%。为与原研制剂的片重保持一致，自研片重应在合理范围内波动，不足部分用乳糖填充。根据星点设计的原理，各因素设置5水平，该设计是在两水平析因设计的基础上加上极值和中心点构成的，其代码分别为 0、±1、±α，α=(F)1/4，F=2k(k为因素数)为析因设计部分试验次数［4］。对于三因素的星点设计，以缓释片的综合评分L值和相似因子f2值作为考察指标，采用Design Expert 8.0安排实验，并对结果进行分析。因素及水平表见表2，具体实验方案见表5。

表2 星点设计的因素和水平

参照《中国药典》2010版二部附录XIX D缓释、控释和迟释制剂指导原则的规定，采用累积释放度综合评分法，对不同处方3、9、12、18 h四点的释放度进行评分，将评分结果进行加权相加后得出总分，各点的评分方法参照美国药典(USP)标准，3、9、12、18 h 的释放度以 15%、55%、65%、75%，各点权重均设为1，总分的计算公式为:

L=︱P3－15%︱+︱P9－55%︱+︱P15－61%︱+︱P18－75%︱，L值越小，因素的水平数越佳。

采用相似因子法［10］，是指实验制剂与对照制剂的累积释放度差的平方和最小。计算公式如下:

式中n为取样点总数，Rt和Tt分别为参比、实验制剂的在t时的平均释放度。f2值越接近100，曲线的相似性越好，f2大于50(50～100)说明两条曲线相似。

对于因变量L值要求越小越好，而对于f2值则要求越大越好。考虑到当f2值最大时L值并不一定最小，选择总评“归一值”法 (overall desirability，OD)，即将每个指标标准化为0～1之间的数值，各指标“归一值”求算几何平均数，得总评“归一值”。对于综合评分法和相似因子法采用Hassan方法分别进行数学转换求“归一值”［11］。OD值越大，因素水平数越佳。

以HPMC K100M和HPMC K15M用量和乙醇浓度为自变量，总评“归一值”为因变量，进行多元线性回归和二次多项式回归，并以拟合优度(r)和置信度(P)作为模型判定标准。拟合方程为

多元线性模型:

二次多项式模型:

由拟合所得到的模型绘制因素X1、X2、X3对指标的效应面图和等高线图。通过固定三个自变量中之一为中值，以总评“归一值”为因变量相对于另外两个自变量绘制效应面三维图，最后根据效应面优选处方［12］。

3 结果和讨论

3.1 释放度分析方法 双丙戊酸钠对照溶液均在210 nm附近有最大吸收，且辅料在此范围内无明显吸收，对主药测定无干扰。以吸光度A对浓度C进行线性回归，得到回归方程 A=2.17 ×10－2C －1.7×10－3，r=0.999 8 结果表明双丙戊酸钠在浓度 0.410～12.64 mg·L－1线性关系良好，精密度、中间精密度、溶液稳定性均较好，回收率在96% ～104%范围内，说明本研究所采用的释放度方法学准确度高。

3.2 Plackett-Burman试验设计与结果 7个因素与4个空白因素合计12次实验，按照Plackett-Burman设计表进行试验设计，每个试验号重复3次，计算f2值。Plackett-Burman实验设计和响应值见表3。运用Design-expert 8.0软件对各因素进行显著性分析，见表4。

表3 Plackett-Burman实验设计和响应值

表4 Plackett-Burman试验结果方差分析

结果显示P＜0.05的因素为主要影响因素［6］。结论:对各因素的显著性分析可以看出，各因素对响应值影响的显著性顺序为B＞A＞E＞G＞C＞D＞F，显著性因素为 B(HPMC K100M)、A(HPMC K15M)和E(乙醇浓度)。

3.3 星点设计－效应面法

3.3.1 模型拟合 根据星点设计原理，确定因素水平见表2，实验设计及研究结果，如L值、f2值和OD值，见表5。

表5 星点设计实验结果

采用多元线性模型对各影响因素和指标进行回归计算，其方程如下:

采用二次多项式对各影响因素和指标进行数学模型拟合，方程如下:

为了保证模型拟合良好，需要检查回归模型的显著性、模型系数的显著性和失拟项的显著性［13］。方差分析结果见表6，通常情况下，F值越大，P值越小，对应的模型系数就越显著，F值的失拟项为2.34相对于纯误差不显著，校正拟合度和预测拟合度相关性良好，信噪比为20.501＞4等均表明回归方程可以很好的预测因素和效应值的关系。由拟合模型的r值可以看出多元线性模型拟合较差，二次多项式模型拟合较好，对系数采用置信度P＞0.05为不显著，剔除不显著的模型系数，由表6可知剔除系数A、B。优化后模型的r值没有明显减小，所以模型仍具有较高可信度，优化后的方程为:

表6 二次模型响应面的方差分析

3.3.2 效应面优化 选择优化后的方程为模型，应用Design Expert 8.0软件，以OD值为纵坐标，固定3个自变量中1个为中值，其他2个自变量为横坐标，绘制三维效应面 (response surface)图［15］，如图1～3。

由图1可见，在一定范围内，随着 HPMC K100M用量增大，OD值增大，HPMC K15M对OD值有先增大后减小的趋势。图2中乙醇浓度增大，OD值增大，HPMC K100M增大，OD值增大，增大到某一值后，HPMC K100M反而减小，这是因为随着HPMC K100M用量增大所占片重比例增大，此时HPMC K15M和乙醇浓度已经不能调节药物的释放，图3中随着K15M和乙醇浓度增大，OD值先增大后减小，但乙醇浓度对OD值的影响较HPMC K15M、HPMC K100M小，这也验证了 Plackett-Burman试验结果。

由效应面优化的基本原理选取较佳处方区域回推至因素的取值范围［16］，由软件自动优化后得到最佳处方结果为 HPMC K100M 286.72 mg，HPMC K15M 16.96 mg，乙醇浓度 27%。

3.3.3 处方验证 按优化的处方制备3批双丙戊酸钠缓释片，每批1 000片，按公式“偏差=(预测值－实际值)/预测值×100%”计算偏差，结果见表7，考察自研片三批与原研片在标准介质中的累积释放度，见图4，说明所建模型具有很好的预测能力。

表7 预测值与实测值比较(n=3)

4 讨论

利用Plackett-Burman设计用于固体制剂处方与工艺优化的相关文献报道较少。由于影响缓释片释放度的因素较多，如骨架材料的黏度和用量、填充剂的种类和用量、黏合剂的种类和用量、制备工艺、压片的压力等。本研究在预实验的基础上采用了Plackett-Burman设计并运用相似因子f2值为指标筛选了影响双丙戊酸钠缓释片的主要影响因素，并运用多因素五水平的星点设计进行非线性拟合，此种方法具有操作简单、试验次数少、精度高、预测性好等优点［16］。实验结果表明二次多项式回归对实验中各因素和指标进行拟合，优化后相关系数(r)较佳，可以作为分析及预测的模型。同时通过效应面优化，从三维效应面图和二维等高线图中可以得到较佳处方，按照较佳处方制备3批双丙戊酸钠缓释片，各批的实测值与预测值的偏差均较小。

亲水凝胶型骨架缓释片研发的核心问题是骨架材料的种类以及用量的选择。通过分别考察不同黏度的羟丙基甲基纤维素，发现采用单一的骨架材料难以满足溶出实验的需求，因此本实验选取了HPMC K100M和HPMC K15M联合作为骨架材料，其中HPMC K100M用于控制后半段药物释放速率，HPMC K15M用于提高前半段药物释放速率，使其能迅速达到治疗窗口血药浓度，两者联合可以有效的控制药物的释放［17－19］。

在实验中发现润湿剂乙醇浓度对药物释放行为影响较大，不同浓度乙醇对溶出度的影响主要是通过影响颗粒的比表面积来影响药物的释放行为，高浓度的乙醇制粒，由于乙醇的挥发速率较快，颗粒表面的致孔作用较为明显，使颗粒的比表面积增大，从而促进药物的释放。

以往的实验设计的考察都是以某个点或者某几个点的释放度作为指标，这不能反应出药物的体内外相关性，也不能完全体现原研制剂和自研制剂在内在品质的差异，给接下来的生物等效性实验埋下了隐患。目前通用的药物溶出度评测指标为相似因子f2，它反应的是自研与原研样品溶出曲线在图形上的相似性，为了更好的比较原研与自研的差别，反映出两者在内在品质上的相似性，本实验引入了L值作为第二个评价指标，L值反映的是每个点自研和原研相比的波动情况。由于相似因子f2值的最佳与L值最佳不一定完全吻合，因此本实验选择总评“归一值”进行最终评价。

在骨架型缓释片的研究中引入Plackett-Burman设计联合星点设计－效应面法进行实验设计，可以大大的减少处方实验的数量，同时对药物的溶出特性有了科学而全面的认识，对于提高我国的仿制药行业的水平有着重要意义。

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