王莉娜，周世媛，张 华，王凤羽，谢建生，杨 博，周继苹

1)河南省人口和计划生育科学技术研究院优生遗传室 郑州450002 2)深圳市妇幼保健院产前诊断中心 深圳518000 3)郑州大学第三附属医院检验科郑州450052

△女，1979年10月生，硕士，主治医师，研究方向:出生缺陷干预、产前诊断，E-mail:wangliyana1979@126．com

22q11．2 微缺失综合征(22q11．2 microdeletion syndrome，22q11．2DS)也称为颚心面综合征或Digeorge 综合征，主要是由于22q11．2 微缺失所致，发病率为1∶4 000［1］。该病患者主要临床表现是:先天性心脏病(特别是圆锥动脉干畸形)、颚异常、特征性面容、学习困难、免疫缺陷等［2］。该病为常染色体显性遗传病，大部分为新发突变［3］。临床上对该病的治疗尚无有效的方法，因此早诊断、早治疗非常重要。目前对22q11．2DS 的实验室诊断主要是采用荧光原位杂交技术(FISH)和多重连接探针扩增技术(MLPA)。2种方法各有优缺点，作者联合使用2种检测手段对可疑22q11．2DS 胎儿进行检测，同时进一步分析22q11．2DS 的基因检测结果与临床表现的关系，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1．1 研究对象及样本采集 孕妇，女，30岁，平素月经规律，身体未发现其他异常情况。孕24 周胎儿彩超系统筛查显示:胎儿心脏发育异常(法洛四联症合并房间隔缺损)。孕妇在穿刺前行血常规、凝血四项、传染病、胎儿超声等常规检查。在无发热、穿刺部位无敏感不适、无凝血异常、胎儿羊水量足够的情况下，告知相关风险，孕妇签署知情同意书后行羊膜腔穿刺。然后采集孕妇及其丈夫的全血样本。

1．2 样本处理

1．2．1 羊水样本DNA 提取 取5 mL 羊水样本，3 000 r/min 离心10 min，弃上清，利用Thermo Scientific King Fisher 自动磁珠提取纯化仪从羊水胎儿脱落细胞提取基因组DNA。

1．2．2 全血样本DNA 提取 取200 μL 全血样本，利用Thermo Scientific King Fisher 自动磁珠提取纯化仪从全血中提取基因组DNA。

1．3 实验方法 羊水和全血样本进行常规染色体核型分析的同时，另取准备好的羊水样本和全血样本的基因组DNA 进行MLPA 检测，异常结果的样本再进行FISH 检测。

1．3．1 MLPA 检测 采用荷兰MRC-Holland 公司的微缺失检测试剂盒进行检测。将准备好的基因组DNA 依次进行变性、杂交、MLPA 连接反应和常规PCR，最后将PCR 反应产物在CEQ8800 Genetic Analysis 分析仪进行电泳。CEQ8800 Genetic Analysis分析仪收集荧光信号并自动生成MLPA 图谱。用MRC-Holland 公司提供的GeneMarker 软件对图谱进行分析。

1．3．2 羊水、全血培养后染色体核型分析 羊水、全血培养后按照常规步骤进行染色体核型分析［4］。

1．3．3 FISH 检测 采用双色荧光探针进行检测。目标基因为22q11．2 区域的TUPLE1 基因，显示红色荧光信号;对照基因为22q13．3 区域的ARSA 基因，显示绿色荧光信号。按照FISH 常规操作程序进行制片、干燥、变性、杂交、后洗、染色和镜检。

2 结果

2．1 常规染色体核型分析结果 羊水和全血样本常规染色体核型分析结果显示，均未发现明显的结构和数目异常。

2．2 MLPA 检测结果 与22q11．2DS 相关的探针有6个，胎儿的电泳图(图1)显示，22q11．21 区域196、208、371 信号均降低约0．5。胎儿父母的电泳图中未见异常。

图1 MLPA 检测扩增电泳图

2．3 FISH 检测结果 正常细胞显示:单个中期细胞核中红色信号及绿色信号均为2个。异常细胞显示:红色信号1个，绿色信号2个，表示TUPLE1 基因发生缺失;红色信号2个，绿色信号1个，表示ARSA 基因发生缺失。FISH 检测结果显示为TUPLE1 基因发生缺失(图2)。

图2 FISH 检测羊水样本的荧光图(×1 000)

3 讨论

先天性心脏病是一类因胚胎期心血管系统发育异常所引起的先天性的畸形，是我国出生缺陷检测的重大疾病之一。病因有三大类:遗传、环境、遗传与环境共同作用。其中遗传因素中常见的是染色体异常(如21 三体综合征和18 三体综合征)，现有研究［5］证实22q11．2DS 是最常见的引起先天性心脏病的遗传因素之一。对于22q11．2DS 的诊断，细胞遗传学水平的检测不能满足临床的需要。该实验常规细胞染色体核型分析结果显示全血和胎儿样本的染色体核型分析均正常，无法检测到22q11．2DS。目前检测22q11．2DS 的方法还有FISH 检测、MLPA 检测和全基因组微阵列检测。FISH 检测因其探针数有限，仅能检测到与探针相对应的缺失，该实验中FISH 方法仅检测TUPLE1 基因缺失;但是FISH 技术对操作者的技术和实验环境的要求相对较高。而全基因组微阵列技术无论对人员还是对设备要求均较高。MLPA技术将DNA 探针技术和PCR 技术相结合，能够快速、高通量、方便、精确地检测出基因变异和变异位点［6］。该实验采用MLPA 技术进行检测，结果寻找到了3种与22q11．2DS 致病相关的信号，增加了对22q11．2DS 致病机制研究的信息量。

22q11．2DS 的临床表现复杂多样，目前已经报道的表型有180种之多。这些表型在各个患者的表现存在较大的个体差异。22q11．2DS 的临床表现还有一定的时间差异性，即随着个体的发育逐渐显现出来［7］。该实验MLPA 检测结果显示22q11．21 区域196、208、371信号均降低，196信号相对应的是CLDN5 基因，208 信号相对应的是GP1BB 基因，371信号相对应的是SNAP29 基因。研究资料［8］显示，CLDN5 基因与眼部疾病有关。GP1BB 和SNAP29 基因是诊断22q11．2DS 的关键基因［9］，与先天性心脏畸形的发生有很大相关性［10-11］。通过MLPA 对22q11．2DS的检测可为22q11．2DS 胎儿的心外畸形推测、手术风险评估、治疗方案选择［12］等提供更多有用信息。

74%的22q11．2DS 患有先天性疾病，特别是圆锥动脉干畸形［2］。有研究［13］认为:先天性心脏病患者，无论是否合并有其他畸形或异常，均应进行22q11．2DS 的检测。22q11．2DS 携带者，无论其临床表现如何，其后代获得这一染色体异常的几率都是50%，并且后代有可能表现为严重的综合征。因此及时、准确地进行产前诊断可以有效避免这种缺陷患儿的出生，尤其是对先天性心脏病高危妊娠的妇女。当胎儿或患儿有相关缺失时，均应对其父母进行同样的检测，以便为其进行再发风险遗传咨询。该实验采用的MLPA 技术无论从技术操作还是从人力、物力上均可达到临床检测的要求。

综上所述，与FISH 技术相比，MLPA 技术能够及时、准确诊断22q11．2DS，为其后续的治疗和预后判断提供了大量的信息。

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