吴 余，崔 静，王 虹，付琳琳，李 航，田明振，冯思佳，杨 璐，赵二趁，千新来，原志庆

新乡医学院病理学教研室新乡453003

高危型人乳头瘤病毒(high risk-human papillomaviruses，HR-HPVs)(如HPV16 等)病毒癌基因E6的持续表达是宫颈癌最重要的致病因素［1］。该课题组设计并筛选了靶向HPV16 E6 且沉默效应均达95%以上的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，经Agilent 人基因组表达谱芯片分析，发现沉默E6 表达后粘蛋白抗原16(mucin antigen 16，MUC16)基因表达下调。MUC16 是否是HPV16 E6的直接作用靶点及调控机制尚不清楚。因此，深入研究E6 与MUC16 的关系，对探索HPV16 相关肿瘤新的治疗方法具有重要意义。该实验以HPV16 E6阳性和阴性的宫颈癌细胞系和宫颈鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织为研究对象，采用Western blot 和免疫组化方法，从细胞和组织水平分析HPV16 E6 和MUC16 表达的关系，以丰富HPV16 E6 的致癌机制。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 细胞 HPV16 阳性的宫颈癌CaSki 细胞和SiHa 细胞以及HPV16 阴性的宫颈癌C-33A 细胞均购自中国科学院上海细胞库。培养条件均为含体积分数10%胎牛血清和双抗(青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L)的高糖DMEM 培养基，在37℃、体积分数5% CO2孵箱中培养。

1．1．2 组织标本来源 从新乡医学院第三附属医院和新乡市第一人民医院收集宫颈鳞癌组织184例。每例标本常规制备石蜡切片(厚约3 μm)。

1．1．3 主要试剂 胎牛血清为杭州四季青公司产品;DMEM 培养基为美国Millipore 公司产品;二硫苏糖醇(DTT)、丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)为德国Merk 公司产品;鼠抗人βactin 单克隆抗体、山羊抗HPV16 E6 多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗鼠二抗、辣根酶标记的兔抗山羊二抗、辣根酶标记的山羊抗兔二抗和增强化学发光试剂盒均为美国Santa Cruz 公司产品;兔抗人MUC16多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;DAB 试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司;免疫组化试剂盒为美国Zymed 公司产品。

1．2 Western blot 方法检测HPV16 E6 及MUC16的表达 常规培养、消化并收集细胞，提取总蛋白。取10 μL 按Bradford 方法进行蛋白定量，对其余蛋白进行变性处理，将1/5 蛋白体积的DTT 和4/5 蛋白体积的2 ×SDS 上样缓冲液与蛋白样品混匀后放入沸水中煮5 min，－80℃保存备用。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后进行Western blot 检测E6 和MUC16 的表达。以β-actin 为内参，蛋白上样量均为150 μg，鼠抗人β-actin 单克隆抗体、山羊抗HPV16 E6 多克隆抗体、兔抗人MUC16 多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗鼠二抗、辣根酶标记的兔抗山羊二抗和辣根酶标记的山羊抗兔二抗稀释度分别为1∶1 000、1 ∶300、1 ∶500、1 ∶5 000、1 ∶5 000 和1∶5 000。采用Bandscan 5．0 软件分析目的条带与内参条带的灰度比值。实验重复3次。

1．3 免疫组化方法检测HPV16 E6 及MUC16 的表达 采用PV-9000 法。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，在枸橼酸盐抗原修复液(pH =6．0)中进行微波修复，体积分数3% H2O2溶液室温孵育20 min、正常山羊血清室温孵育20 min 后，加稀释好的一抗工作液(HPV16 E6 为1∶50，MUC16为1∶100)，以PBS 代替一抗作为阴性对照。加通用型IgG 抗体-辣根过氧化物酶多聚体，室温孵育30 min。显色，复染，经梯度乙醇、二甲苯处理后，中性树胶封片，镜检。E6 为细胞核染色，MUC16 为细胞质和细胞膜染色。400 倍镜下选取5个视野(每个视野计数细胞不少于200个)，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定［2］。①按细胞着色深浅评分:无色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别评为0、1、2、3 分。②按阳性细胞百分比评分:无阳性细胞、阳性细胞百分比＜30%、30%～70%、＞70%分别评为0、1、2、3 分。取2 项评分之和作为总分，0～1 分为阴性，≥2 分为阳性。

1．4 统计学处理 采用SPSS 16．0 进行分析。不同组间MUC16 蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t 检验。HPV16 E6 阳性和阴性鳞癌组织中MUC16 阳性表达率的比较采用χ2检验。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 Western blot 方法检测HPV16 阳性和阴性宫颈癌细胞中E6 的表达 Western blot 结果(图1)显示:C-33A 细胞中HPV16 E6 无表达，CaSki 细胞和SiHa 细胞中可见HPV16 E6 表达。

图1 Western blot 方法检测HPV16 阳性和阴性宫颈癌细胞中E6 的表达

2．2 Western blot 方法检测HPV16 阳性和阴性宫颈癌细胞中MUC16 的表达 Western blot 结果(图2、表1)显示:C-33A 细胞中MUC16 的表达低于Si-Ha 细胞和CaSki 细胞，CaSki 细胞和SiHa 细胞中MUC16 的表达差异无统计学意义。

2．3 宫颈鳞癌组织分组 免疫组化染色结果(图3)显示:184例宫颈鳞癌组织中，HPV16 E6 阳性宫颈鳞癌组织138例，HPV16 E6 阴性宫颈鳞癌组织46例。

图2 Western blot 方法检测HPV16 阳性和阴性宫颈癌细胞中MUC16 的表达

表1 Western blot 方法检测HPV16 阳性和阴性宫颈癌细胞中MUC16 的表达(n=3)

图3 HPV16 E6 阳性(A)和阴性(B)宫颈鳞癌组织染色结果(PV-9000，×200)

2．4 HPV16 E6 阳性和阴性宫颈鳞癌组织中MUC16 的表达 免疫组化染色结果(表2、图4)显示:MUC16 阳性染色主要定位于细胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒;HPV16 E6 阳性宫颈鳞癌组织中MUC16 的表达高于HPV16 E6 阴性宫颈鳞癌组织。

表2 MUC16 在HPV16 E6阳性和阴性宫颈鳞癌组织中的表达

图4 宫颈鳞癌组织中MUC16 阳性(A)和阴性(B)表达(PV-9000，×200)

3 讨论

HPVs 感染宿主后，其早期基因E6 整合入宿主细胞基因组DNA 中并恒定表达。E6 蛋白能与宿主细胞内的E6 相关蛋白(E6 associated protein，E6AP)形成E6-E6AP 复合物，该复合物可与P53 结合形成E6-E6AP-P53 复合物，通过泛素依赖途径使P53 降解失活，易导致细胞发生恶性转化［3-4］。该课题组设计并筛选了靶向HPV16 E6 且沉默效应均达95%以上的shRNA，经Agilent 人基因组表达谱芯片分析，发现沉默E6 表达后MUC16 基因表达下调。因此，深入研究E6 与MUC16 的关系，对丰富HPV16 E6的致癌机制，探索HPV16 相关肿瘤新的治疗方法具有重要意义。

MUC16 又称CA125，是卵巢癌的重要标志物。MUC16 在宫颈癌、胰腺癌、卵巢癌组织中均表达增高［5-7］。研究显示:①MUC16 激活Janus 蛋白酪氨酸激酶2(Janus kinase 2，JAK2)-信号转导和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)信号通路，磷酸化的STAT3 能反式激活c-Jun，诱导cyclinD1 表达增加，促进细胞增殖［8］。②MUC16 通过与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体相互作用，抑制细胞凋亡［9］。③MUC16 高表达可诱导肿瘤细胞侵袭能力增强［10］。

该研究中，Western blot 结果显示，C-33A 细胞中MUC16 的表达低于SiHa 细胞和CaSki 细胞，CaSki 细胞和SiHa 细胞中MUC16 的表达差异无统计学意义。免疫组化结果显示，HPV16 E6 阳性宫颈鳞癌组织中MUC16 的表达高于HPV16 E6 阴性宫颈鳞癌组织。说明MUC16 与HPV16 E6 的表达有关，MUC16 在HPV16 相关宫颈癌发生发展中可能发挥重要作用。上述结果也提示在宫颈癌发生发展过程中，E6 和MUC16 之间可能存在直接或间接的调控关系，其详细调控机制尚有待于进一步研究。

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