崔渊博，马珊珊，姚 宁，渠瑞娜，王欣欣，邢 衢，孟 楠，杨 波#，关方霞#

1)郑州大学生命科学学院 郑州450001 2)郑州大学第一附属医院神经外科 郑州450052

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为进行性学习记忆能力减退、空间认知功能障碍以及人格和行为改变等症状，病因迄今未明。APP+转基因鼠模型能够较好地模拟AD 的临床特征。人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)是来源于人体脐带沃顿胶组织中的多能干细胞，具有分离培养简易、自我更新能力强和分化潜能多向等特点［1］。研究［2-3］发现hUCMSCs 在体内外条件下可诱导分化为神经元样细胞，为AD 的治疗带来新的希望。课题组前期研究［3］发现间充质干细胞尾静脉移植治疗AD APP+转基因鼠能够明显改善小鼠的学习记忆能力，并且安全有效，但其分子机制并不十分清楚。关于衰老的机制有自由基学说、端粒酶学说、遗传程序学说等多种学说。已有研究［4］发现，某些基因与细胞衰老过程密切相关，可将它们概括为细胞周期调控基因、端粒酶调控基因、生长抑制基因以及核酸、蛋白质合成与修复基因等;另外，衰老还与一些反式作用转录因子基因的活性变化有关，其中有抑癌基因p16、p53、p21、沉默信息调节因子家族(Sirtuins)、增殖细胞核抗原(PCNA)等。这些衰老相关基因之间相互联系，可能构成细胞衰老的基因调控链。该研究利用APP+转基因鼠为实验对象，观察hUC-MSCs 移植对其学习记忆能力及组织内衰老相关基因表达的影响，从行为学水平和分子水平两个方面探讨hUC-MSCs 静脉移植延缓APP+转基因鼠衰老的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料试剂 实验所用hUC-MSCs 由课题组前期冻存。DMEM/F12 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶消化液、胶原酶Ⅳ、购自鼎国昌盛生物技术公司，逆转录试剂盒、荧光定量PCR SYBR Premix 试剂盒购自TaKaRa 公司，APP 引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，兔抗人Sirt2、PCNA、p16、p21、p53 多克隆抗体均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1．2 APP 转基因小鼠的鉴定和分组 清洁级C57BL/6 APP 转基因鼠购自中国协和医科大学动物所，合笼繁殖。采用PCR 方法对出生后的APP 转基因小鼠进行分子生物学鉴定。剪取0．5 cm 左右小鼠尾巴，提取DNA，PCR 扩增APP 基因，鉴定APP+转基因鼠。APP 基因上游引物序列5'-CCCT GAACCTGAAACATAAAAT-3'，下游引物序列5'-GC TACGAAAATCCAACCTACAA-3'。APP+转基因鼠随机分为hUC-MSCs 移植组和对照组，每组6只。

1．3 hUC-MSCs 的移植 复苏并传代培养hUCMSCs，传至第3 代用DMEM/F12 培养基将细胞调成密度为1 ×106mL－1的细胞悬液;移植组中的每只APP+转基因鼠经尾静脉注射细胞悬液0．5 mL，对照组APP+转基因鼠经尾静脉注射同等体积的生理盐水。

1．4 小鼠学习记忆能力的Morris 水迷宫实验检测

1．4．1 准备及适应训练 小鼠专用水迷宫水池直径120 cm，高40 cm，分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个象限。平台放在第Ⅰ象限水中的中心位置，平台直径15 cm，水温控制为(25 ±1)℃。正式实验前1 周为适应练习期。在整个实验过程中，水迷宫位置、方向及周围环境保持不变。每只小鼠每天入水训练2次，间隔时间由其他小鼠进行训练，适应训练过程持续1 周。

1．4．2 空间探索测试 从细胞移植第5 周结束起，开始进行正式实验。将适应训练后的小鼠以组为单位依次从4个不同象限放入水池中，观察并记录小鼠游泳轨迹。利用摄像采集器记录下3个参数:穿越平台次数、逃避潜伏期(从入水开始到找到平台所用时间)和在平台所在象限停留时间。

1．4．3 反向探索测试 反向探索测试阶段，将平台位置对调放置于第Ⅳ象限中心位置。测试方法同空间探索测试，依次将每只鼠从4个不同象限放入水池中，观察小鼠游泳轨迹。记录上述3个参数。

1．5 各组小鼠脑、肝组织中衰老相关基因mRNA表达的荧光定量PCR 检测 Morris 水迷宫实验结束后，移植组和对照组小鼠各选3只，处死小鼠，取出脑及肝脏组织，加入液氮后研磨，用Trizol 裂解组织提取总RNA，具体操作按照说明书进行。然后取1 μL RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性、浓度和纯度，分装后－80℃保存备用。利用逆转录试剂盒，取1 μg 总RNA 反转录为cDNA。以小鼠GAPDH 作为内参，按照荧光定量PCR 试剂盒说明书配制反应体系，利用Fast 7500 Real Time System进行实时荧光定量PCR，每个样品设3个复孔。反应条件为95℃30 s，95℃3 s，60℃30 s，40个循环。反应结束后观察记录扩增曲线和熔解曲线。数据分析采用比较CT 法(ΔΔCT)，相对表达量(RQ)=2－ΔΔCT，取3次平均值作图。实验所用相关引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物序列

1．6 各组小鼠脑、肝组织中衰老相关蛋白表达的Western blot 检测 收集各组小鼠的脑组织和肝脏组织，提取总蛋白，测蛋白浓度。取100 μg 总蛋白加入5×上样缓冲液，沸水中煮10 min，再迅速冰浴5 min，分装后置于－20℃保存备用。经SDS-PAGE 凝胶电泳及转膜后用P16、P21、P53、Sirt2 和PCNA 抗体杂交，采用ECL 化学发光法检测，晾干后扫描结果。1．7 统计学处理 采用SPSS 17．0 进行分析。应用两独立样本t 检验分析2组小鼠脑组织和肝脏组织中衰老相关基因mRNA 及蛋白相对表达量的差异。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 APP+转基因鼠的鉴定 5月龄APP 转基因鼠经PCR 扩增APP 基因进行分子生物学鉴定，电泳结果显示扩增出284 bp 条带的为APP+转基因鼠，该实验共获得12只鼠。

2．2 APP+转基因鼠学习记忆能力检测 见表2。与对照组相比，移植组APP+转基因鼠逃避潜伏期时间缩短、穿越平台次数增加，在平台所在象限停留的时间延长。

表2 hUC-MSCs 移植后2组小鼠水迷宫测试结果

2．3 2组小鼠脑、肝组织中衰老相关基因表达的变化 见图1 和表3、4。与对照组相比，移植组小鼠脑组织中p21、p53 mRNA 和蛋白的表达降低，PCNA、Sirt2 mRNA 和蛋白的表达升高，而p16 的表达变化不明显。

2．4 2组小鼠肝组织中衰老相关基因表达的变化见图2 和表5、6。移植组小鼠肝组织中PCNA、Sirt2 mRNA 和蛋白的表达明显高于对照组，p21、p53 mRNA 和蛋白的表达显著低于对照组，差异具有统计学意义，而p16 表达的变化不明显。

图1 2组小鼠脑组织中衰老相关蛋白表达的变化

表3 2组小鼠脑组织中衰老相关基因mRNA 表达的变化

表4 2组小鼠脑组织中衰老相关蛋白表达的变化

图2 各组小鼠肝组织中衰老相关蛋白表达的变化

表5 各组小鼠肝组织中衰老相关基因mRNA 表达的变化

表6 各组小鼠肝组织中衰老相关蛋白表达的变化

3 讨论

随着AD 的发病率逐年上升，寻找有效治疗AD的方法显得尤为迫切。近年来，干细胞在神经系统退行性疾病的研究和应用取得了令人鼓舞的进展［5］。研究［6］表明神经干细胞移植能够显著改善APP+转基因鼠学习记忆功能。但神经干细胞受标本来源及细胞扩增数量的影响，骨髓干细胞不适合从年幼或高龄患者采集。In't Anker 等［7］从脐带中培养出脐带MSCs，经免疫表型鉴定与骨髓来源的MSCs 相似，且比骨髓来源的MSCs 具有更强的扩增能力和分化能力，而且不存在伦理学和免疫排斥等问题，对中枢神经系统损伤具有良好的神经修复作用［8］，从而为组织工程、细胞工程和干细胞治疗提供新的干细胞来源。近年来，随着分子生物学技术的发展，已经发现某些基因与细胞衰老密切相关。衰老的细胞停滞于G 期，不能顺利进入S 期。细胞周期的停滞是细胞衰老的前提，细胞衰老伴随着细胞形态改变和相关基因表达的变化。调控细胞周期主要有两个信号通路［9］:一条是损伤信号激活了P53，P53 激活P21，P21 抑制CDK2 导致pRb 去磷酸化，最终导致细胞衰老［10-11］;另一条途径是某些衰老信号激活了P16，P16 抑制CDK4/6 导致pRb去磷酸化，影响细胞周期，从而导致细胞衰老［12］。

研究［13］表明p16 基因过表达可抑制293 细胞的增殖，将细胞周期阻滞在G0/G1期，促进细胞衰老。除此之外，PCNA 作为DNA 聚合酶的附属蛋白，能够增加DNA 聚合酶活性，在DNA 复制和细胞的分裂增殖中发挥作用。Sirt2 能够介导端粒及核糖体基因簇的转录沉默，参与大量与衰老有关的病理生理过程［14］，有利于防止细胞早衰和过分化。

在该研究中，作者将hUC-MSCs 静脉移植APP+转基因鼠，发现在脑组织和肝组织细胞中存在P21、P53 表达的降低和PCNA、Sirt2 表达的升高，而P16表达变化不明显。该研究结果提示MSCs 调控细胞衰老的机制可能主要是通过P53/P21 信号通路，而不是P16 信号通路。移植后3 周经Morris 水迷宫实验测定，移植组平均穿越平台次数明显增加，逃避潜伏期时间明显缩短，即学习记忆能力明显改善。该研究表明hUC-MSCs 通过调控细胞中衰老相关基因的表达进而影响细胞衰老过程，改善APP+转基因鼠的学习记忆功能，这可能是hUC-MSCs 延缓APP+转基因鼠衰老的机制之一。该研究将为从基因角度探讨生命衰老发生机制及寻找有效治疗AD 方法提供依据。

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