季江 冷红 冀胜军 苏玉华 施辛 田野 曹建平

瘢痕疙瘩及其成纤维细胞p16基因甲基化状态和相关基因表达研究

季江 冷红 冀胜军 苏玉华 施辛 田野 曹建平

目的 探讨瘢痕疙瘩中成纤维细胞p16基因甲基化在其发生发展中的作用。方法 分离、培养来自瘢痕疙瘩皮损和健康人皮肤原代成纤维细胞；免疫组化法检测瘢痕疙瘩皮损中p16表达情况；实时荧光定量PCR检测瘢痕疙瘩成纤维细胞中p16、DNA甲基转移酶mRNA表达；亚硫酸氢盐修饰后测序（BSP法）检测瘢痕疙瘩皮损及培养的原代成纤维细胞p16基因甲基化状态。结果 瘢痕疙瘩成纤维细胞中p16基因mRNA表达低于健康人皮肤成纤维细胞（相对表达量2-ΔΔCt分别为0.64±0.18和1.92±0.23，t=10.54，P<0.05）。瘢痕疙瘩成纤维细胞三种DNA甲基转移酶（DNMT）基因mRNA表达水平（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B分别为2.58±0.23、4.87±0.46、1.57±0.12）与健康人皮肤成纤维细胞（分别为1.13±0.21、2.38±0.32、0.57±0.16）相比均存在高表达，两组比较，t值分别为11.22、10.81、12.45，均P<0.05。瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩原代成纤维细胞内p16启动子区甲基化程度分别为1.81%±0.46%和3.15%±0.94%，明显高于健康人皮肤组织（0.90%±0.35%，F=14.23，P<0.01）和原代成纤维细胞（0.17%±0.29%，F=37.62，P<0.01）。结论 瘢痕疙瘩成纤维细胞中p16基因甲基化及其低表达与瘢痕疙瘩的失控性生长可能相关，DNA甲基转移酶在其发病中可能起一定作用。

瘢痕疙瘩；成纤维细胞；基因，p16；甲基化；甲基转移酶类

瘢痕疙瘩是遗传易感性患者皮肤损伤后组织异常修复的结果。因其所具备的持续性生长、切除后易复发和向健康皮肤侵袭生长的临床特点，目前作为一种肿瘤而进行研究［1］。其主要功能细胞瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFb）不受正常细胞周期控制时，增殖超过凋亡。此种平衡关系的改变可能与基因的结构和功能异常有关，多个基因表达及其相互之间信息传递与调控上的某种异常可能是引起成纤维细胞过度增殖和胶原过度合成的重要原因［2］。我们的研究表明，瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力强于健康人皮肤成纤维细胞（待发表），细胞周期也存在异常，因此有必要进一步检测瘢痕疙瘩皮损及KFb细胞周期相关基因表达情况，并对启动子区甲基化状态、DNA甲基转移酶（DNMT）的基因表达情况进行研究。

材料和方法

一、标本来源

本研究经苏州大学附属第二医院伦理委员会批准。标本取自整形美容外科和皮肤科手术治疗的患者，并征得患者书面同意。入选标准：经临床和组织病理检查确诊的瘢痕疙瘩患者，病程超过1年，皮损超过伤口范围，呈浸润持续生长，有发红、痒、痛等临床症状；未经手术、激光、冷冻、糖皮质激素皮损内注射等治疗。排除标准：正常瘢痕、增生性瘢痕、年龄大于60岁的患者。健康人标本取自美容手术无相应疾病患者。

二、瘢痕疙瘩皮损组织病理和p16免疫组化检测

将标本以4%甲醛固定、石蜡包埋，常规制备免疫组化石蜡切片。免疫组化（Envision二步法）检测按试剂盒说明书操作。实验结果依据成纤维细胞阳性细胞数及染色强弱评分，即先按阳性细胞比例将无、0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计为0、1、2、3、4分；再按染色强度将无、弱、中、强分别计为0、1、2、3 分，最后综合两部分得分即为总分。每张切片由2名病理医师分别采用半定量系统评价，所有结果都在双盲法下判定。

三、瘢痕疙瘩患者皮损及健康人皮肤原代成纤维细胞（分别简称KFb和NFb）的分离、培养和鉴定

局麻下切取瘢痕疙瘩皮损组织或健康人皮肤标本，去除皮下脂肪组织，置中性蛋白酶（Dispase II 2 U/ml，德国罗氏试剂）、胶原酶（200 U/L）（美国Sigma公司）溶液中，37℃水浴4 h，分离表真皮；将分离的真皮剪碎，放入胶原酶（200 U/L）溶液中，37℃水浴3 h，消化分散、收集成纤维细胞液，加一定量的完全培养液，200目筛网过滤，收集过滤的细胞悬液，低速离心；洗后细胞种植于50ml培养瓶，加入含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/L

采用SPSS 16.0统计软件进行统计学处理。计量资料以±s表示，采用t检验和单因素方差分析（One-way ANOVA）进行显著性检验，两组间比较采链霉素的DMEM培养基（美国Gibco公司），置37℃5%CO2培养箱中进行原代培养；2～3 d换液1次，待梭形成纤维细胞布满瓶底时，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA混合消化液消化细胞并传代增殖。以下所有实验选用第4～7代细胞。原代成纤维细胞采用免疫荧光鉴定，4%多聚甲醛固定，加0.3%Tritonx-100破细胞膜，血清封闭，加入鼠抗人波形蛋白（美国Abcam公司）一抗孵育2 h，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后加入羊抗鼠荧光二抗孵育1 h，最后再进行DAPI复染核，荧光显微镜观察。阴性对照不加一抗。

四、p16和DNMT基因表达检测

取KFb和NFb，利用Trizol法提取总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA第1链。PCR反应体系为：SYBR Green 1 Mix（ferment）10μl、上游引物 1μl、下游引物 1μl、待测样品 cDNA 1μl和 ddH2O 7μl。利用SYBR Green法，在ABI 7500实时定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应条件为：93℃2min预变性，然后按93℃1min，55℃1min，72℃1min，共40个循环，最后72℃7min延伸。实验中各产物的片段长度、引物序列见表1。采用2-ΔΔCt方法分析结果，对于每个基因，计算两组之间基因表达倍数改变。

表1 PCR引物序列表

五、p16基因启动子区甲基化状态检测

p16基因（CDKN2A）有38个CpG岛。采用重亚硫酸盐修饰后克隆测序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP），根据序列设计并合成1对BSP引物，对需要分析的片段进行PCR扩增，通过蓝白斑筛选，挑选5个白色的克隆接种于3ml LB（Luria-Bertani）液体培养基中；质粒小量提取试剂盒（Axygen，美国santacruze公司）提取质粒，并送上海英拜生物科技有限公司测序；在http://quma.cdb.riken.jp/网站上对各样本测序结果进行甲基化程度分析。

六、统计学处理

用最小显著差法（Least Significant Difference,LSD）。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、临床资料

瘢痕疙瘩患者12例，男女各6例；年龄12～49（34.78±9.83）岁；病程 16～110（35.68±12.72）个月；瘢痕疙瘩主要分布在前胸、肩背、颈项、耳廓等。健康人对照组12例，男5例，女7例；年龄18～42（38.09±6.34）岁。两组的性别构成比及年龄差异均无统计学意义（P＞0.05）。

二、皮损组织病理和免疫组化检测

所有入选者组织均经病理检查，HE染色证实为瘢痕疙瘩组织或者健康人皮肤组织。p16免疫组化结果示，健康人皮肤真皮内成纤维细胞胞核呈阳性（图1A），而瘢痕疙瘩组织呈阴性（图1B），仅个别汗腺细胞p16染色阳性。健康人皮肤和瘢痕疙瘩组织免疫组化评分值分别为3.92±1.08和1.75±0.75，两组比较，t=5.69，P<0.001。

图1 瘢痕疙瘩组织和健康人皮肤p16免疫组化染色 1A：健康人皮肤组织（×100）；1B：瘢痕疙瘩组织（×40）。健康人皮肤可见真皮内成纤维细胞的胞核染色阳性，呈棕色颗粒；而瘢痕疙瘩组织阴性，仅个别汗腺细胞p16染色阳性（箭头）

三、原代成纤维细胞的分离、培养和鉴定

消化分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖，约2周左右原代细胞铺满瓶底，胞体细长呈长梭形，核卵圆形居中，细胞呈栅栏状、漩涡状生长。免疫荧光染色显示，培养的细胞核呈蓝色，卵圆形，胞质呈绿色红色荧光，波形蛋白表达阳性。

四、实时定量PCR技术检测p16和DNMT基因的表达

实时定量PCR检测KFb和NFb中p16基因的表达和p16甲基化调控相关基因 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B表达的变化，相应熔点曲线Tm值分别为89.15、87.04、80.95 和 87.60。KFb中 DNMT1、DNMT3A、DNMT3B mRNA表达分别为2.58±0.23、4.87±0.46、1.57±0.12，明显高于NFb（分别为1.13±0.21、2.38±0.32、0.57±0.16），两组比较，t值分别为11.22、10.81、12.45，均P<0.05。而KFb中p16基因mRNA表达低于 NFb（分别为0.64±0.18和 1.92±0.23，t=10.54，P<0.05）。

五、BSP检测p16基因启动子区甲基化状态

瘢痕疙瘩皮损组织、KFb原代细胞DNA经重亚硫酸盐结合后进行PCR检测，成功扩增出451 bp的目的片段（图2）。原代培养的KFb和NFb各6例，瘢痕疙瘩组织和健康人皮肤组织各10例行BSP检测（图3）。测序结果显示，瘢痕疙瘩组织和KFb内p16启动子区甲基化程度分别为1.81%±0.46%和3.15%±0.94%，明显高于健康人皮肤组织（0.90%±0.35%，F=14.23，P<0.01）和 NFb（0.17%±0.29%，F=37.62，P<0.01）。

图2 瘢痕疙瘩组织和瘢痕疙瘩原代皮肤成纤维细胞p16启动子区PCR结果M：标准参照物；1～10：分别为瘢痕疙瘩组织标本；11～16：分别为瘢痕疙瘩原代皮肤成纤维细胞。PCR产物为451 bp

图3 瘢痕疙瘩原代皮肤成纤维细胞和健康对照原代皮肤成纤维细胞BSP检测p16基因启动子甲基化结果 每个圆圈代表1个CG，黑圈代表甲基化，白圈代表未甲基化；每1行代表该样本的1个克隆测序结果中所有的CG，每份样本5个克隆；右侧为CG甲基化检测阳性率。K1～K3：为瘢痕疙瘩原代皮肤成纤维细胞；N1～N3：为健康对照原代皮肤成纤维细胞

讨 论

瘢痕疙瘩在临床表现上与肿瘤有很多相似之处，以较多的胶原沉积为其特征。新型的抗肿瘤药物，如表观遗传调控药物、甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷（AZA）、组蛋白脱乙酰酶（HDAC）抑制剂曲古菌素A，已在实验研究中证实能有效治疗瘢痕疙瘩［3-5］，说明瘢痕疙瘩是具有一定肿瘤特性的病变。但瘢痕疙瘩不具备肿瘤的转移特性，在病理学方面也有较大区别，并不具有肿瘤的异形性、核分裂、增殖能力。

肿瘤的特征是不平衡的甲基化。在肿瘤中，伴随基因组低甲基化的是区域性的高甲基化及DNA甲基化转移酶基因高表达［6-7］。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，由DNMT催化S腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5甲基胞嘧啶（mC），在真核生物DNA中，5甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基［8-9］。CpG岛的甲基化模式具有种属和组织特异性，至少由3种DNMT相互作用后形成，包括维持哺乳类动物DNA甲基化的DNMT1，有重新甲基化活性的DNMT3a和DNMT3b。我们的研究发现，KFb 3种DNMT mRNA表达均高于NFb，提示DNMT对瘢痕疙瘩的甲基化进程起一定作用。有文献报道［10］认为，DNMT与瘢痕疙瘩的浸润生长以及进行性生长存在密切联系，提示瘢痕疙瘩存在异常的甲基化状态。有研究表明，采用甲基转移酶抑制剂AZA可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及促进凋亡，而对正常皮肤的成纤维细胞无明显影响［11］。

前期研究表明，KFb在细胞增殖及DNA合成代谢等多个方面均明显高于NFb；细胞周期检测表明，KFb存在G2/M期阻滞［12-13］。p16基因又名多肿瘤抑制基因1（MTS1），其基因编码产物P16蛋白可通过与细胞周期依赖性激酶（CDK）4结合而使其失活，从而阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞的过度增殖。p16基因启动子区域的高甲基化使基因沉默，P16蛋白不能表达［14-15］。我们的研究发现，瘢痕疙瘩皮损及其成纤维细胞p16基因低表达，其启动区CpG岛中存在甲基化现象，但甲基化程度与肿瘤细胞相比还存在较大差异［16］。

综上，我们的研究表明，瘢痕疙瘩中主要的功能细胞成纤维细胞在DNA甲基转移酶的作用下，出现表观遗传学相关改变，p16基因启动子区呈现甲基化状态，影响该基因的表达，继而可能出现细胞周期、细胞增殖异常，表现相应临床症状。

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2014-06-11）

（本文编辑：颜艳）

Methylation status of p16 gene and expressions of related genes in keloid tissue and cultured keloid fibroblasts

Ji Jiang,Leng Hong,Ji Shengjun,Su Yuhua,Shi Xin,Tian Ye,Cao Jianping.Department of Dermatology,Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China

Tian Ye,Email:dryetian65@hotmail.com

ObjectiveTo explore the role of p16 gene methylation in fibroblasts in the occurrence and development of keloid.MethodsSkin tissue specimens were resected from the lesions of patients with keloid and normal skin of healthy human controls.Fibroblasts were isolated from these tissue specimens and subjected a primary culture.An immunohistochemical analysis was performed to measure the expression of p16 protein in tissue specimens,real-time fluorescence-based quantitative PCR to determine the mRNA expression level（expressed as 2-△△Ct）of p16 and DNA methyltransferases（DNMTs）in fibroblasts,and bisulfite sequencing PCR（BSP）to estimate the methylation status of p16 gene in the tissue specimens and primary fibroblasts.ResultsThe keloid fibroblasts （KFbs） showed significantly lower mRNA expression of p16 gene（0.64±0.18 vs.1.92±0.23,t=10.54,P<0.05）,but significantly higher mRNA expressions of 3 DNMTs（DNMT1:2.58±0.23 vs.1.13±0.21,t=11.22,P<0.05;DNMT3A:4.87±0.46 vs.2.38±0.32,t=10.81,P<0.05;DNMT3B:1.57±0.12 vs.0.57±0.16,t=12.45,P<0.05）compared with the normal fibroblasts （NFbs）.The DNA methylation rate in the p16 gene promoter region was significantly increased in keloid tissue（1.81%±0.46%）and KFbs（3.15%±0.94%）compared with normal skin tissue（0.90%±0.35%,F=14.23,P<0.01）and NFbs （0.17%±0.29%,F=37.62,P<0.01）.ConclusionsThe methylation and low expression of p16 gene in KFbs may be associated with the uncontrolled growth of keloid,and DNMTs may play a role in the pathogenesis of keloid.

Keloid;Fibroblasts;Genes,p16;Methylation;Methyltransferases

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.007

国家自然科学基金（81172128、81402517）；江苏省放射医学与防护重点实验室开放课题（KJS1244）；江苏省临床医学科技专项（BL2014040）

215004苏州大学附属第二医院皮肤科［季江（Email：drjiangji@gmail.com）、冷红、苏玉华、施辛］，肿瘤放疗科（冀胜军、田野）；苏州大学医学部放射医学与公共卫生学院（曹建平）

田野，Email：dryetian65@hotmail.com