王沛 周城 王雨馨 温广东 刘萍 于聪 廖文俊 张建中

常染色体隐性遗传念珠状发一例及其家系基因突变研究

王沛 周城 王雨馨 温广东 刘萍 于聪 廖文俊 张建中

目的 报道国内首例常染色体隐性遗传念珠状发，对患者及其父母桥粒芯糖蛋白4编码基因（DSG4）进行突变研究。方法 抽取1例念珠状发患儿及其父母外周血，提取血液基因组DNA，同时取100例健康汉族人基因组DNA样品作对照，采用PCR方法扩增DSG4基因16个外显子，并对产物进行测序分析。结果 患儿DSG4基因存在2个杂合突变，突变1为第8外显子移位突变c.837delA（p.E280Rfs*4），突变2为第16外显子无义突变c.2389C＞T（p.R797*）。对其父母的基因分析证明，突变1来自其父亲，突变2来自其母亲。100例健康对照均未发现该杂合突变。结论 DSG4基因的2个杂合突变c.837delA（p.E280Rfs*4）和c.2389C＞T（p.R797*）导致该常染色体隐性遗传念珠状发家系的临床表型，2个突变均导致DSG4基因翻译的提前终止。

念珠形发；稀毛症；皮肤疾病,遗传性；桥粒芯糖蛋白质类；突变；桥粒芯糖蛋白4基因

念珠状发（monilethrix，OMIM：158000）是一种罕见的毛干结构异常伴毛囊改变的先天性秃发症，属于单基因遗传性疾病。念珠状发多以常染色体显性方式遗传，已发现常染色体显性遗传念珠状发的致病基因为3种Ⅱ型毛发角蛋白的编码基因：KRTHB1（KRT81）、KRTHB3（KRT83）和 KRTHB6（KRT86），国内外已有多个家系报道证实［1-2］。近年来，国外报道了数例以常染色体隐性遗传伴有念珠状发样改变的先天性稀毛症家系，部分学者将其命名为常染色体隐性遗传念珠状发，并发现其致病基因为桥粒芯糖蛋白 4（desmoglein 4，DSG4）编码基因［3］。目前常染色体隐性遗传念珠状发在国内尚无报道，本文报道1例常染色体隐性遗传念珠状发，并对其进行DSG4基因的突变研究。

对象与方法

一、临床资料

先证者男，11岁，汉族。患儿出生时头皮正常，无头发，出生后逐渐有少量头发长出，睫毛、眉毛正常。8个月大时头皮开始出现针尖样丘疹，与毛囊分布一致，其上毛发变细、断裂，留下毛囊角化性丘疹，类似的皮损也逐渐增多并扩展至颈部和四肢伸侧。1岁余时睫毛和眉毛开始脱落、变短，颜色变淡，逐渐出现和头皮类似的毛囊角化性丘疹。脱发情况春重冬轻。指（趾）甲正常，龋齿较多，牙齿上有裂纹。外院曾诊为小棘状毛壅症，使用中药及抗真菌药物治疗无效。患儿生长发育与同龄儿无异，身高、体重、智力均正常。父母均体健，非近亲结婚，家族中无类似疾病患者。皮肤科检查：头发稀疏，头皮、颈部可见成片的毛囊性丘疹，针头大小，中央可见一黑色角栓，剥出角栓可见其内含有碎毛，毛囊周围可见红斑；眉毛和睫毛稀疏、短小（图1、2）；脱落的头发无毛囊，多为从毛干下部断裂形成的断发。光镜下可见部分头发粗细不均，头发弯折、断裂。牙齿无光泽，有裂纹，指（趾）甲正常。皮肤镜下可见黑点征样改变，粗大的毛发大致正常，部分头发细小、折断，可见串珠样改变（图3、4）。父母毛发密度和分布均正常。初步诊断：念珠状发。

对照组100例来自于北京大学人民医院皮肤科收集的无先天性秃发表现或家族史的正常人，均为汉族。

图1 患者头皮毛发和眉毛稀疏、短小

图2 患者后颈部散在片状毛囊角化性丘疹，毛囊周围可见红斑

图3 皮肤镜下可见大量断发，黑点征样改变（×10）

图4 部分细小毛发可见串珠样改变（×20）

二、实验方法

1.DNA提取：受检者签署知情同意书后，取家系先证者及其父母外周血5ml，2%乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝，使用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技公司）提取基因组DNA。

2.PCR及测序：扩增DSG4基因片段，按照文献［4］提供的序列合成DSG4基因特异性PCR引物，共15对，覆盖DSG4基因所有16个外显子及其侧翼序列。以基因组DNA为模板进行扩增，采用50μl体系，扩增条件为：95℃预变性7min后，94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃后延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物。

3.DSG4基因扩增产物测序：PCR扩增产物经凝胶电泳回收纯化后，送北京天一辉远生物科技有限公司测序，测序方法为Sanger双脱氧链终止法（Sanger法）。测序结果采用 BLAST软件及DNAMAN6.0软件与DSG4基因序列进行比对。

4.验证：100例毛发正常受试者每例取外周血3ml作为对照组，按上述方法提取基因组DNA，并扩增患者发生突变的相应外显子进行测序。

结 果

所有引物在模板DNA中均扩增出目标条带，产物切胶纯化后测序，结果清晰无杂峰干扰。将所测得的序列与UCSC数据库（http://genome.ucsc.edu）公布的正常序列进行对比，排除已知单核苷酸多态性（SNP）之后得到如下结果：先证者第8外显子存在1个杂合移码突变c.837delA（p.E280Rfs*4）（突变1），该突变导致第280位密码子由GAG变为AGA，并在其后形成翻译提前终止密码子（PTC）；第16外显子存在一杂合突变c.2389C＞T（p.R797*）（突变2），导致第797位密码子CGA变成了TGA，编码的氨基酸由精氨酸变为终止密码，形成另一处PTC。测序结果见图5。

随后对先证者父母DSG4基因突变进行验证，结果发现其父亲存在c.837delA（p.E280Rfs*4），母亲存在c.2389C＞T（p.R797*），先证者DSG4的2个突变分别来自于其父母。在100例健康对照中未发现此杂合突变。测序结果见图5。

图5 DSG4第8和第16号外显子测序结果 A：患儿第8号外显子c.837delA突变；B：其父第8号外显子c.837delA突变；C：第8号外显子健康对照；D：患儿第16号外显子c.2389C＞T突变；E：其母第16号外显子c.2389C＞T突变；F：第16号外显子健康对照

讨 论

本文报道国内首例DSG4基因突变所致的常染色体隐性遗传念珠状发，在使用毛发镜和突变分析前该患者长期被误诊为小棘状毛壅症。临床诊断念珠状发的关键是找到典型的发干结构改变，但由于念珠状发脆性增加，所以通常有明显异常的毛干在长出头皮不久即在近毛根处发生断裂，尤其是当发生典型念珠状发改变的毛发比例较少时，采集进行光镜或扫描电镜检查的较长头发往往因外观正常而容易漏诊。常染色体隐性遗传念珠状发的典型念珠状发改变常常仅发生于非常细小的头发，更易漏诊和误诊。

过去认为念珠状发为常染色体显性遗传，其致病基因为3种角蛋白基因 KRT81、KRT83和KRT86。近年来国际上相继报道了数例常染色体隐性遗传的念珠状发，并发现其致病基因为桥粒芯糖蛋白4［4］。桥粒是角质形成细胞间连接的基本结构，桥粒芯糖蛋白是其组成部分之一。毛囊细胞的分化需要骨形态发生蛋白（BMP）、膜信号转导因子、生长因子在内的多种分子通路的参与，细胞间的联接网络为这些信号诱导细胞增殖和分化提供了最基础的保障［5］。2003年 Whittock 等［6］从基因水平定位描述了一个和桥粒芯糖蛋白1、2、3同源的新人类桥粒芯糖蛋白，并将其命名为桥粒芯糖蛋白4，其编码基因为DSG4基因，DSG4位于18号染色体18q12、DSG1与DSG3的编码基因之间，由16个外显子组成，cDNA全长3.6 kb。

DSG4属于钙黏蛋白超家族，是桥粒的重要部分，常在表皮和毛囊表达。Kljuic等［5］最早通过两个巴基斯坦家系的研究发现，DSG4的突变导致局限性常染色体隐性遗传性稀毛症（localized autosomal recessive hypotrichosis,LAH）的发病。LAH临床表现和常染色体显性遗传念珠状发相似，但病发毛干在电镜下未发现念珠状结构。2006年Shimomura等［4］、Zlotogorski等［7］和 Schaffer等［8］分别报道了 DSG4 基因突变导致的伴串珠样结构异常的先天性秃发病例，其临床表现与常染色体显性遗传念珠状发也非常相似，筛查Ⅱ型角蛋白基因结果为阴性，后将该病命名为念珠状发样先天性稀毛症。近年来部分学者认为该病为念珠状发的一种常染色体隐性遗传的亚型。由于常染色体隐性遗传念珠状发和LAH的致病基因均为DSG4，临床表现非常相似，差异仅为毛干是否存在念珠状发样改变，这两种疾病是否实为同一疾病，尚存在争议。Wajid等［9］报道的LAH家系中虽没有出现典型的念珠样发，但毛干偶尔也可以观察到念珠发样的凸起结构。我们认为常染色体隐性遗传念珠状发和LAH是同一种疾病，使用皮肤镜能比电镜更容易发现细小的、比例较少的、有念珠状发样改变的毛发，但还需要更多的病例报告和突变研究来证实。

目前我们所知，与常染色体隐性遗传念珠状发和LAH相关的DSG4基因突变共11种，包括错义突变、无义突变、碱基的缺失突变、插入突变、剪接位点突变和大片段缺失突变等［4，7-13］（图6）。其中LAH的DSG4基因突变报道都为纯合子突变，念珠状发几乎均为杂合子突变（仅1例纯合P267R突变例外）。不同的突变位点会导致临床症状的表现不一，纯合突变症状相对较重，有明显的临床异质性。本研究中突变c.837delA和c.2389C＞T分别发生在细胞外第3结构域和细胞内结构域（图6）。根据Peltz等［14］提出的无义介导的mRNA降解原则（nonsense-mediated mRNA decay，NMD），异常 mRNA将被细胞识别并清除，但在哺乳动物细胞中，PTC下游至少有一个外显子-外显子连接（exon-exon junction，EEJ）才能启动清除［15］。本文患者的第1 个PTC位于第8外显子，根据该定律，其翻译产物将被大量降解，不会形成蛋白产物。第2个PTC位于第16外显子，由于位于基因最末外显子，所以我们认为它很可能躲避NMD监控而形成一个缩短的产物，从而保留部分DSG4的功能，因此临床表现相对较轻，该突变导致桥粒芯糖蛋白C-端结构的缺失，影响DSG和桥粒斑珠蛋白（PG）的连接，导致细胞间连接系统的缺陷［16］。

图6 DSG4结构域模式图及已经报道过的突变位点。其中S为信号结构域，P为前蛋白结构域，ECⅠ～ECⅣ为细胞外结构域，EA为细胞外锚定结构域，TM为跨膜结构域，IC为细胞内结构域。a：为本家系新发现的2个突变位点

本研究在国内首次报道常染色体隐性遗传念珠状发，并通过对其进行基因突变分析，发现了2个DSG4基因的新突变，c.837delA和c.2389C＞T，丰富了该病的遗传及临床数据库，并为该病临床上的正确诊断、将来基因型与表型的相互关系研究以及DSG4在毛囊生长中的功能研究提供了依据。

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2014-05-05）

（本文编辑：周良佳 颜艳）

Autosomal recessive monilethrix:a case report and mutation analysis

Wang Pei*,Zhou Cheng,Wang Yuxin,Wen Guangdong,Liu Ping,Yu Cong,Liao Wenjun,Zhang Jianzhong.*Department of Dermatology,Peking University People′s Hospital,Beijing 100044,China

Zhang Jianzhong,Email:rmzjz@126.com

ObjectiveTo report the first case of autosomal recessive monilethrix in China,and to study the mutations in the desmoglein 4 （DSG4）gene in the patient and his parents.MethodsPeripheral blood samples were obtained from an 11-year-old boy with monilethrix,his parents and 100 healthy human controls of Han nationality.Genomic DNA was extracted from these samples,and PCR was performed to amplify 16 exons of the DSG4 gene followed by DNA sequencing.ResultsThere were 2 heterozygous mutations in the DSG4 gene in the patient,including a translocation mutation c.837delA（p.E280Rfs*4）in exon 8 and a nonsense mutation c.2389C ＞ T（p.R797*）in exon 16.Gene analysis in the parents revealed that the translocation mutation and nonsense mutation were inherited from the father and mother respectively.Neither of the two mutations was found in the 100 healthy controls.ConclusionsThe two heterozygous mutations c.837delA （p.E280Rfs*4）and c.2389C ＞T （p.R797*）in the DSG4 gene,both of which lead to premature termination of translation of the DSG4 gene,may be responsible for the clinical phenotype of autosomal recessive monilethrix in this family.

Monilethrix;Hypotrichosis;Skin diseases,genetic;Desmogleins;Mutation;Desmoglein 4 gene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.004

国家自然科学基金（81201221）

100044北京大学人民医院皮肤科（王沛、周城、王雨馨、温广东、刘萍、于聪、张建中）；第四军医大学西京皮肤医院（廖文俊）

张建中，Email：rmzjz@126.com