刘欣欣 罗素菊 郑焱 许文娟 李颖 刘全忠

白细胞介素22诱导HaCaT细胞表达肝素结合表皮生长因子样生长因子的作用机制探讨

刘欣欣 罗素菊 郑焱 许文娟 李颖 刘全忠

目的 探讨白细胞介素22（IL-22）诱导HaCaT细胞表达肝素结合表皮生长因子样生长因子（HBEGF）的相关作用机制。方法 用不同浓度的IL-22（12.5、25、50、100μg/L）干预处理HaCaT细胞，对照组选择等量磷酸盐缓冲液（PBS）处理。24 h后，提取HaCaT细胞总蛋白进行蛋白免疫印迹，检测丝裂原活化蛋白激酶-细胞外信号调节激酶1/2（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）的表达和转录激活因子途径（JAK/STAT）中磷酸化 JAK2（P-JAK2）和磷酸化 STAT3（P-STAT3）的表达。将HaCaT细胞分 4组，分别用 PBS、IL-22、MAPK-ERK1/2抑制剂PD98059、JAK2/STAT3通路抑制剂AG490与IL-22共同干预HaCaT细胞，24 h后，提取细胞总蛋白和总mRNA，分别用蛋白免疫印迹法和实时定量逆转录（RT）-PCR法检测不同处理组HB-EGF蛋白和mRNA水平的改变。采用SPSS16.0软件进行单因素方差分析检验组间差异，Bonferroni检验进行多重比较。结果 不同浓度的IL-22干预处理后，HaCaT细胞中P-ERK1/2、P-JAK2和P-STAT3蛋白表达均高于对照组（P<0.05）。HB-EGF蛋白水平（HB-EGF/内参照的灰度比值）在PD98059组和AG490组分别为0.183±0.020和0.199±0.011，与 IL-22组（0.924±0.032）相比，差异具有统计学意义（F值分别为37.700、36.400，均P<0.05）。HB-EGF mRNA水平在PD98059组和AG490组分别为1.034±0.072和0.989±0.038，与IL-22组（1.844±0.135）相比，差异具有统计学意义（F值分别为11.271、13.429，均P<0.05）。结论 IL-22可以引起HaCaT细胞中MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3这两条信号通路激活。IL-22诱导HaCaT细胞产生HB-EGF蛋白的作用机制可能与MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3这两条信号通路有关。

白细胞介素-22；成纤维细胞生长因子1；角蛋白细胞；丝裂原激活蛋白激酶类；Janus激酶2；STAT3转录因子；银屑病；HaCaT细胞

目前研究认为，银屑病的发病机制主要是由T细胞介导的以表皮角质形成细胞为靶点的免疫应答反应。在其发病过程中Th17、Th22细胞及其细胞因子发挥重要作用。白细胞介素22（IL-22）为Th22细胞分泌的主要细胞因子，参与调节机体免疫反应。国内外研究表明，银屑病患者外周血及皮损中IL-22水平较健康人高，且IL-22水平的高低与银屑病严重程度密切相关［1-3］。肝素结合表皮生长因子样生长因子（HB-EGF）是表皮生长因子家族中的一员，可促进细胞的增殖，在银屑病皮损中表达增高，并且其表达量与银屑病病情相关［4］，提示其在银屑病表皮异常增殖中发挥重要作用。以往研究表明，细胞外调节蛋白激酶（ERK）和信号转导与转录激活因子3（STAT3）这两种信号通路蛋白在角质形成细胞增殖信号传导中至关重要［5］。我们的研究表明，IL-22可在基因和蛋白水平促进HaCaT细胞HBEGF的表达（未发表）。在本研究中，我们检测IL-22对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK-ERK1/2）通路中磷酸化ERK1/2（P-ERK1/2）和转录激活因子途径（JAK/STAT）中磷酸化JAK2（P-JAK2）和磷酸化STAT3（P-STAT3）的影响，并通过抑制其信号传导检测其是否影响HaCaT细胞HB-EGF的表达，探讨其可能的作用机制。

材料和方法

一、实验材料

1.实验细胞：HaCaT细胞系德国柏林自由大学本杰明·富兰克林医学中心惠赠，为我实验室长期冻存细胞。

2.主要试剂：重组人IL-22（美国Protein Specialists 公 司），P-ERK1/2、P-JAK2、JAK2、PSTAT3、STAT3、辣根过氧化物酶标记（HRP）-羊抗兔的二抗（美国CST公司），β肌动蛋白、HRP-羊抗鼠的二抗、HRP-兔抗山羊二抗（北京中杉金桥公司），ECL发光显色液、荧光Mix（美国Invitrogen公司），PD98059、AG490（美国 Millipore公司），DMEM培养基（美国Gibico公司），Thermo逆转录试剂盒（美国Thermo公司），HB-EGF抗体、HB-EGF蛋白ELISA试剂盒（美国RD公司）。HB-EGF及β肌动蛋白的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3.主要仪器：酶联免疫检测仪（美国Biotek公司），凝胶成像系统仪（英国Cambridge公司），实时定量PCR仪（美国Bio-Rad公司），CO2孵育箱（美国Forma Scientific公司）。

二、实验方法

1.HaCaT细胞的复苏与培养：将冻存的HaCaT细胞复苏后，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液，于5%CO2、37℃条件下培养。待HaCaT细胞90%融合后，用0.25%胰酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化进行传代培养。

2.HaCaT细胞的干预处理：将经传代培养后处于对数生长期的细胞消化后，以1×105/ml接种于6孔板，37℃、5%CO2孵育培养。待细胞70%～80%融合时，进行饥饿处理2～3 h后，更换新的培养液，分别用 12.5、25、50、100μg/L 重组人 IL-22 进行干预，对照组用等量磷酸盐缓冲液（PBS）干预。继续于37℃、5%CO2孵育培养 24 h。

3.蛋白免疫印迹检测信号通路相关蛋白：干预处理后的HaCaT细胞，用预冷PBS洗3遍，每孔加300μl细胞裂解液和2μl蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）。冰上裂解30min，用EP管收集细胞裂解液离心10min。测蛋白浓度后进行Western印迹。取上清，10%聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳，每孔上样量 25μl，电泳 90min，稳流 300 mA 转膜 40min，转膜后的硝酸纤维素膜分别用兔抗人一抗（PERK1/2、P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3）4 ℃孵育过夜，后洗涤，用二抗（HRP标记的羊抗兔二抗）室温孵育2 h，ECL暗室曝光显色。检测P-ERK1/2、PSTAT3、P-JAK2的表达情况。每组实验重复3次。

4.细胞信号通路阻断剂阻断实验：

（1）细胞干预处理：对接种培养的HaCaT细胞分为4 组：①阴性对照组：PBS；②IL-22 组：50μg/L IL-22；③PD98059 组：50μmol/L PD98059+50μg/L IL-22；④AG490 组：50μmol/L AG490+50μg/L IL-22。抑制剂的选择及使用浓度参照文献［6-7］。

（2）蛋白免疫印迹检测HB-EGF蛋白水平的改变：干预培养24 h后，按上述方法提取各组细胞的总蛋白进行蛋白免疫印迹，检测HB-EGF蛋白水平的改变。实验重复3次。

（3）实时荧光定量RT-PCR检测HB-EGF基因水平的改变：干预处理24 h后吸去培养液，用PBS洗2遍，用Trizol试剂提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测吸光度（A260nm/A280nm），检测RNA的纯度及浓度。应用逆转录试剂盒合成cDNA。荧光定量PCR 反应体系：25μl，冰上加样荧光定量 Mix12.5μl，上下游引物各 0.25μl，模板 cDNA 2μl，无 RNA 酶的双蒸水10μl。按照试剂盒说明设定反应条件50℃2min促使尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）激活：然后95℃，2min预变性，1个循环；95℃15 s变性，60℃1min退火延伸，40个循环。进行熔解曲线分析判定PCR反应的特异性。HB-EGF上游引物：5′-GGCTCCCTCCTGCATCTG-3′，下游引物：5′-AGGAT GGTTGTGTGGTCATAGGT-3′。β肌动蛋白上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物：5′-CTGATCCACATCTGCTGGAA-3′。合成的cDNA进行实时定量PCR扩增。每个样本设3个复孔。上述RT-PCR实验重复3次。

（4）ELISA法检测HB-EGF蛋白的表达：采用双抗体夹心ELISA法，参照试剂盒使用说明书进行。用酶标仪在450 nm波长处测量各孔的吸光度。每个样本重复3次。制作样品浓度标准曲线，并据其计算各样品的浓度。应用二喹啉甲酸（BCA）法测样品总蛋白浓度。统计不同样品HB-EGF蛋白浓度与总蛋白浓度的比值。

三、统计结果处理

结 果

一、IL-22干预后HaCaT细胞中P-ERK1/2、PSTAT3、P-JAK2蛋白的表达

免疫印迹结果显示，12.5、25、50、100μg/L IL-22干预处理后，HaCaT细胞MAPK通路中P-ERK1/2表达量、JAK2/STAT3通路中P-STAT3表达量、PJAK2表达量均较对照组升高（表1），且与IL-22浓度有一定相关关系。3次重复实验结果类似（图1、2）。参照课题组前期研究及信号通路蛋白表达选择50μg/L的IL-22进行信号通路阻断实验。

表1 IL-22干预后HaCaT细胞中P-ERK1/2、P-STAT3、P-JAK2蛋白的表达量（与β肌动蛋白灰度比值，±s）

表1 IL-22干预后HaCaT细胞中P-ERK1/2、P-STAT3、P-JAK2蛋白的表达量（与β肌动蛋白灰度比值，±s）

注：n=3

组别 P-ERK1/2 P-STAT3 P-JAK2 IL-22干预组12.5μg/L 0.588±0.043 0.755±0.091 0.358±0.069 25μg/L 0.625±0.032 0.823±0.060 0.454±0.053 50μg/L 0.857±0.068 0.906±0.097 0.531±0.093 100μg/L 0.975±0.057 0.984±0.119 0.843±0.078对照组 0.324±0.108 0.460±0.106 0.130±0.017 F值 42.55 13.01 44.95 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

图1 白细胞介素22（IL-22）对HaCaT细胞MAPK通路蛋白ERK及P-ERK表达的影响 1：对照组；2～5：分别为12.5、25、50、100μg/L IL-22 组

图2 白细胞介素22（IL-22）对HaCaT细胞JAK2/STAT3通路蛋白表达的影响 1：对照组；2～5：分别为12.5、25、50、100μg/L IL-22组

图3 部分信号通路阻断HaCaT细胞中肝素结合表皮生长因子样生长因子的表达 1：对照组；2：50μg/L IL-22；3：50μg/L IL-22+PD98059；4：50μg/L IL-22+AG490

二、通路阻断实验结果

1.加入信号通路阻断剂后HB-EGF蛋白水平的改变：蛋白免疫印迹结果显示，在加入信号通路阻断剂后，HB-EGF蛋白表达量（HB-EGF/β肌动蛋白灰度比值）PD98059组为0.183±0.020，较IL-22组（0.924±0.032） 降低（F=37.700，P＜0.05）；AG490组（0.199±0.011）也较IL-22组降低（F=36.400，P＜0.05）。结果见图3。

2.加入信号通路阻断剂后HB-EGF mRNA水平的变化：加入信号通路阻断剂后HB-EGF mRNA表达水平均较IL-22组减少。PD98059组HB-EGF mRNA表达水平（2-ΔΔCt）为1.034±0.072，较IL-22组（1.844±0.135）降低（F=11.271，P<0.05）；同时AG490组（0.989±0.038）较IL-22组亦降低（F=13.429，P<0.05）。

三、不同干预处理组HB-EGF蛋白的浓度与总蛋白浓度的比值

在加入信号通路抑制剂后，HB-EGF蛋白表达均较IL-22组降低。HB-EGF与总蛋白浓度比值在对照组为（0.816±0.152）× 10-3，PD98059 组为（0.852±0.159）×10-3，AG490组为（1.049±0.166）×10-3，后两组与 IL-22组（2.067±0.160）× 10-3比较均降低，F值分别为20.933、5.414，均P<0.05。

讨 论

本实验研究结果显示，IL-22可诱导HaCaT细胞MAPK信号通路中P-ERK1/2蛋白表达增加，加入MAPK-ERK1/2通路特异性抑制剂PD98059后，HB-EGF蛋白和mRNA的表达较未加抑制剂组明显降低。提示MAPK-ERK1/2信号通路在IL-22促进HB-EGF的表达中发挥重要作用。同样浓度IL-22干预后，JAK2/STAT3信号通路中P-JAK2和P-STAT3蛋白水平均明显升高。加入JAK2/STAT3通路抑制剂AG490后，HB-EGF无论从蛋白水平还是基因水平均较无抑制组降低。

有研究显示，IL-22可通过促进HaCaT细胞PERK1/2和P-STAT3升高进而引起角蛋白17升高［8］。HB-EGF可促进角质形成细胞的增殖和迁移。研究表明，HB-EGF在正常皮肤表皮中不表达或表达量很低，而在银屑病患者皮损中表达升高，其表达水平与银屑病的严重程度有一定的相关性，提示其在银屑病表皮异常增殖中发挥重要作用［9］。IL-22受体广泛分布于免疫细胞中，参与调控角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞等其他组织细胞的增殖和分化，尤其在角质形成细胞的增殖、分化及免疫中起重要作用［10］。在银屑病皮损中IL-22受体较正常皮肤增多，提示IL-22受体参与银屑病的表皮异常增殖［11］。因此我们推测IL-22通过与HaCaT细胞表面IL-22受体结合引起细胞内通路激活。

银屑病皮损的棘层和基底层角质形成细胞中存在ERK1/2的磷酸化，并且与角质形成细胞的过度增殖相关［12-13］。另外，ERK1/2的磷酸化可促进T细胞活化、增殖和抗凋亡作用［14］。研究表明，在银屑病患者的皮损中STAT3表达明显升高［15-16］。在银屑病患者机体内STAT3参与Th17细胞信号传导过程，与角质形成细胞过度增殖和炎性浸润有关［17］。

综上所述，IL-22可使HaCaT细胞HB-EGF、PERK1/2蛋白、P-JAK2和P-STAT3蛋白水平升高。MAPK-ERK1/2通路特异性抑制剂PD98059和JAK2/STAT3通路抑制剂AG490可明显抑制HBEGF的表达，提示IL-22可能通过MAPK-ERK1/2和JAK2/STAT3这两条通路诱导HB-EGF的表达。提示阻断IL-22信号通路传导可减少HB-EGF的表达，进一步研究可能为治疗银屑病提供一个新的治疗途径。

［1］Kagami S,Rizzo HL,Lee JJ,et al.Circulating Th17,Th22,and Th1 cells are increased in psoriasis［J］.J Invest Dermatol,2010,130（5）:1373-1383.

［2］Sabat R,Wolk K.Research in practice:IL-22 and IL-20:significance for epithelial homeostasis and psoriasis pathogenesis［J］.J Dtsch Dermatol Ges,2011,9（7）:518-523.

［3］史玉玲,徐晓光,毕新岭,等.白介素22及其相关因子在银屑病患者血清及外周血单一核细胞中的表达［J］.中华皮肤科杂志,2011,44（4）:238-240.

［4］Yoshida A,Kanno H,Watabe D,et al.The role of heparin-binding EGF-like growth factor and amphiregulin in the epidermal proliferation of psoriasis in cooperation with TNFα ［J］.Arch Dermatol Res,2008,300（1）:37-45.

［5］Wang Z,Jin C,Li H,et al.GPR48-Induced keratinocyte proliferation occurs through HB-EGF mediated EGFR transactivation［J］.FEBS Lett,2010,584（18）:4057-4062.

［6］Lee H J,Lee H J,Sohn EJ,et al.Inhibition of connexin 26/43 and extracellular-regulated kinase protein plays a critical role in melatonin facilitated gap junctional intercellular communication in hydrogen peroxide-treated HaCaT keratinocyte cells［J/OL］.Evid Based Complement Alternat Med,2012,2012:589365［2013-09-06］.http://www.hindawi.com/journals/ecam/2012/589365/.

［7］Boissel JP,Ohly D,Bros M,et al.The neuronal nitric oxide synthase is upregulated in mouse skin repair and in response to epidermal growth factor in human HaCaT keratinocytes［J］.J Invest Dermatol,2004,123（1）:132-139.

［8］Zhang W,Dang E,Shi X,et al.The pro-inflammatory cytokine IL-22 up-regulates keratin 17 expression in keratinocytes via STAT3 and ERK1/2［J/OL］.PLoS One,2012,7（7）:e40797［2013-06-09］.http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0040797.

［9］Zheng Y,Peng Z,Wang Y,et al.Alteration and significance of heparin-bindingepidermal-growth-factor-like growth factorin psoriatic epidermis［J］.Dermatology,2003,207（1）:22-27.

［10］Sonnenberg GF,Fouser LA,Artis D.Functional biology of the IL-22-IL-22R pathway in regulating immunity and inflammation at barrier surfaces［J］.Adv Immunol,2010,107:1-29.

［11］Tohyama M,Hanakawa Y,Shirakata Y,et al.IL-17 and IL-22 mediate IL-20 subfamily cytokine production in cultured keratinocytes via increased IL-22 receptor expression ［J］.Eur J Immunol,2009,39（10）:2779-2788.

［12］Takahashi H,Ibe M,Nakamura S,et al.Extracellular regulated kinase and c-Jun N-terminal kinase are activated in psoriatic involved epidermis［J］.J Dermatol Sci,2002,30（2）:94-99.

［13］Haase I,Hobbs RM,Romero MR,et al.A role for mitogen-activated protein kinase activation by integrins in the pathogenesis of psoriasis［J］.J Clin Invest,2001,108（4）:527-536.

［14］Laatikainen LE,Incoronato M,Castellone MD,et al.SOD3 decreases ischemic injury derived apoptosis through phosphorylation of Erk1/2,Akt,and FoxO3a［J/OL］.PLoS One,2011,6（8）:e24456［2013-06-14］.http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0024456.

［15］Sano S,Chan KS,Carbajal S,et al.Stat3 links activated keratinocytes and immunocytes required for development of psoriasis in a novel transgenic mouse model［J］.Nat Med,2005,11（1）:43-49.

［16］Andrés RM,Hald A,Johansen C,et al.Studies of Jak/STAT3 expression and signalling in psoriasis identifies STAT3-Ser727 phosphorylation as a modulator of transcriptional activity ［J］.Exp Dermatol,2013,22（5）:323-328.

［17］LiuH,Moroi Y,Yasumoto S,et al.Immunohistochemical localization of activated Stat3 and hTERT protein in psoriasis vulgaris［J］.Eur J Dermatol,2006,16（2）:205-207.

2014-04-24）

（本文编辑：尚淑贤）

Mechanisms underlying interleukin-22-induced expression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor in HaCaT cells

Liu Xinxin*,Luo Suju,Zheng Yan,Xu Wenjuan,Li Ying,Liu Quanzhong.*Department of Dermatology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China

Luo Suju,Email:luosuju2005@163.com

ObjectiveTo investigate the mechanisms underlying interleukin-22（IL-22）-induced expression of heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor（HB-EGF）in HaCaT cells.MethodsSome HaCaT cells were divided into several inverention groups treated with IL-22 at concentrations of 12.5,25,50,100μg/L,respectively and a control group treated with phosphate buffer saline （PBS）.After 24-hour culture,total proteins were extracted from the HaCaT cells,and Western blot was performed to measure the expression of phosphorylated extracellular signalregulated kinase 1/2 （P-ERK1/2）in the mitogen-activated protein kinase （MAPK）-ERK1/2 pathway,as well as phosphorylated-JAK2（P-JAK2）and phosphorylated-signal transducer and activator of transcription 3 （P-STAT3）in the JAK2/STAT3 pathway.In a blocking experiment,some HaCaT cells were divided into 4 groups to be treated with PBS,IL-22,PD98059 （an inhibitor of MAPK-ERK1/2）combined with IL-22 （PD98059 group）,AG490 （an inhibitor of JAK2/STAT3）combined with IL-22 （AG490 group）,respectively.After 24-hour treatment,total proteins and mRNAs were extracted from the HaCaT cells followed by Western blot and real-time quantitative reverse transcription-PCR for the measurement of protein and mRNA expressions of HB-EGF respectively.Statistical analysis was carried out with the software SPSS 16.0 by one-way analysis of variance （ANOVA）for intergroup comparisons and by Bonferroni′s test for multiple comparisons.ResultsAfter treatment with IL-22 at the above 4 concentrations,the expressions of P-ERK1/2,P-JAK2 and P-STAT3 in HaCaT cells were all increased compared with the control group（allP<0.05）.The protein and mRNA expression levels（expressed as the HB-EGF/β-actin ratio and 2-△△Ctrespectively）of HB-EGF were both significantly decreased in the PD98059 group and AG490 group than in the IL-22 group（protein:0.183±0.020 and 0.199±0.011 vs.0.924±0.032,F=37.700,36.400,respectively,bothP＜0.05;mRNA:1.034±0.072 and 0.989±0.038 vs.1.844±0.135,F=11.271,13.429,respectively,bothP＜0.05）.ConclusionsIL-22 can activate the MAPK-ERK1/2 and JAK2/STAT3 signaling pathways in HaCaT cells,which may contribute to IL-22-induced expression of HB-EGF in HaCaT cells.

Interleukin-22;Fibroblast growth factor 1;Keratinocytes;Mitogen-activated protein kinases;Janus kinase 2;STAT3 transcription factor;Psoriasis;HaCaT cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.009

国家自然科学基金（81201231、81371732）

300052天津医科大学总医院皮肤科（刘欣欣、罗素菊、许文娟、刘全忠），肺癌研究所（李颖）；西安交通大学第二医院皮肤科（郑焱）

罗素菊，Email：luosuju2005@163.com