胡彩霞 赵连梅 张国强 田菲 王文氢 高顺强

2-甲氧基雌二醇对恶性黑素瘤B16细胞株增殖与凋亡的影响

胡彩霞 赵连梅 张国强 田菲 王文氢 高顺强

目的 探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对小鼠恶性黑素瘤B16细胞增殖与凋亡的影响，并初步探讨其机制。方法 选用小鼠B16细胞进行体外培养，实验分为阴性对照组和药物处理组，药物处理组加入2-ME，使其终浓度分别为5、10、20、40μmol/L，阴性对照组不加2-ME。作用不同时间后，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；根据磺酰罗丹明B方法测得的各组A490值绘制生长曲线；采用磺酰罗丹明B法检测黑素瘤细胞活性；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡；逆转录PCR和实时PCR法分析凋亡诱导基因（gadd45b）及原癌基因（c-myc）的表达情况。结果 重复测量的方差分析显示，5、10、20、40μmol/L的2-ME作用于黑素瘤细胞不同时间后对其增殖的抑制作用差异有统计学意义（F=1170.94，P<0.01）；上述浓度的2-ME作用24、48、72 h对黑素瘤细胞增殖的抑制作用差异亦有统计学意义（F=1843.04，P<0.01）；药物浓度和培养时间存在交互作用（F=272.79，P<0.01）。10、20、40μmol/L 2-ME作用48 h后，B16细胞的凋亡率分别上升至（4.13±1.12）%、（11.25±2.38）%、（19.46±2.9）%，与阴性对照组［（0.23±0.5）%］相比，差异均有统计学意义（P<0.01）；细胞出现G0/G1期阻滞，对照组细胞、10、20、40μmol/L 2-ME 处理组细胞 G0/G1 期比例分别为（44.1±3.4）%、（59.5±5.6）%、（63.4±8.2）%、（70.8±4.4）%，且随着浓度的增加，G0/G1期细胞明显增加，各处理组及对照组间比较，G0/G1期细胞比例差异有统计学意义（F=13.56，P<0.05）。与阴性对照组相比，20μmol/L和40μmol/L 2-ME作用24 h可升高gadd45b的表达（均P<0.01），10、20、40μmol/L 2-ME均可降低c-myc基因的表达，差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论 2-ME在体外能够抑制小鼠恶性黑素瘤B16细胞的增殖，能够使c-myc基因的表达降低，使gadd45b基因的表达升高。

雌二醇；黑色素瘤，实验性；细胞系，肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；基因,myc；Gadd45基因

恶性黑素瘤早期及时手术治疗可以挽救生命，晚期治疗常不易控制病情的发展，一旦发生侵袭及转移，将会危及生命。因为肿瘤细胞多药耐药性的产生，恶性黑素瘤对达卡巴嗪、替莫唑胺、铂类、长春新碱、紫杉醇等化疗药物可产生耐药性［1］，多种化疗方案治疗均不理想［2］，亟待新的治疗药物的出现。2-甲氧基雌二醇（2-ME）是人体内17-β雌二醇的代谢产物，体外研究发现，其具有潜在的抗多种肿瘤的活性，包括乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、白血病等［3-5］。但关于2-ME对黑素瘤的研究国内尚未见报道。我们观察2-ME对黑素瘤细胞增殖与凋亡的影响，为该药物的临床应用提供实验基础。

材料与方法

一、材料和试剂

2-ME产自美国Cayman公司（批号0433445-9，纯度≥95%）。胎牛血清产自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI 1640和胰蛋白酶产自美国Gibco公司；二甲基亚砜（DMSO）产自天津市永大化学试剂开发中心；碘化丙锭（PI）染料产自杭州联科生物工程有限公司；磺酰罗丹明B（sulphorhodamine B，SRB） 试剂盒产自美国 Sigma公司；瑞－姬（Wright-Giemsa）染液产自珠海Baso公司（批号：18610）；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；q-PCR染料SYBgreen产自大连TaKaRa公司；无水乙醇为国产分析纯。

二、细胞培养

小鼠黑素瘤B16细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液（含青霉素100 U/ml，链霉素100 mg/L）于37℃、5%CO2培养箱中培养，以0.25%胰蛋白酶消化细胞传代，取对数生长期细胞用于实验。

三、SRB法检测B16细胞增殖

实验分为对照组和处理组，以不含细胞的RPMI 1640培养液为空白组。取对数生长期B16细胞悬浮于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中，调整细胞浓度为1.0×105/ml，分别接种于96孔培养板中，每孔100μl，细胞贴壁后，对照组加入含有0.01%DMSO的培养基，药物处理组加入不同浓度的 2-ME 10μl，使其终浓度分别为5、10、20、40μmol/L，继续培养 24、48 和 72 h 后，弃上清，磷酸盐缓冲液（PBS）洗1次，10%三氯乙酸4℃固定1 h，蒸馏水冲洗4～5遍，室温晾干，加4 g/L SRB染液100μl染色15min，弃染液，1%乙酸轻洗4～5遍，滴加100μl 10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Trisbase），摇床上摇晃15min，于492 nm处测吸光度值（A值），每一浓度设立3个复孔，取平均值。倒置相差显微镜观察形态学变化，全自动酶标仪于492 nm波长处测定各孔吸光度A值，按下式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（1－实验组A值/对照组A值）×100%。

四、SRB法绘制生长曲线

实验分为对照组和处理组，取对数生长期B16细胞悬浮于含10%新生牛血清的RPMI 1640完全培养液中，调整细胞浓度为1.0×104/ml，分别接种于96孔培养板中，每孔100μl，细胞贴壁后，对照组加入含有0.01%DMSO的培养基，药物处理组加入不同浓度的 2-ME 10μl，使其终浓度分别为10、20、40μmol/L 继续培养 1、2、3、4、5、6 d，收集细胞，SRB法测A490值，绘制生长曲线。

五、流式细胞仪分析细胞凋亡率和细胞周期

取对数生长期B16细胞进行实验。实验组加入2-ME，终浓度分别为10、20、40μmol/L，对照组加入完全培养基，继续培养48 h后，收集细胞，1 000 r/min（离心半径13.5cm）离心5min，PBS洗涤3次，每次离心 5min，用2ml PBS 重悬细胞 5min ，加入10μlPI，室温反应10min，4℃避光染色30min，用流式细胞仪经Single histogram statistic软件分析细胞凋亡率和细胞周期。每个浓度样本重复3次，结果以±s表示。

六、逆转录-PCR（RT-PCR）和实时定量PCR（real time PCR）检测凋亡相关基因c-myc和生长阻滞与DNA损伤诱导基因45b（gadd45b）的表达

细胞分组同细胞凋亡率和细胞周期检测试验。取对数生长期B16细胞，加入6 mg/L对羟基桂皮醛，于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中继续培养6、12、24 h后，用预冷的PBS洗2遍，提取总RNA，然后用反转录试剂盒反转录为cDNA；以反转录出的cDNA为模板，加入相应目的基因的上下游引物（表1）和qRT-PCR染料后，用ABI 7500定量PCR仪进行检测。实时定量PCR反应条件：95℃5min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s（40个循环）。70～99℃每度8个荧光采集点绘制熔解曲线。普通RTPCR的反应条件为：95℃5min；95℃15s，60℃30s，72℃ 30 s，30个循环；72℃7min，4℃保存。用12 g/L琼脂糖凝胶电泳。

表1 引物序列及扩增条件

七、数据处理

用SPSS13.0统计软件进行统计分析，每组数据取平均值，结果以±s表示，采用单因素方差分析和重复测量的方差分析统计组间和组内差异，其中两两组间比较采用LSD检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、2-ME对黑素瘤B16细胞增殖的影响

重复测量的方差分析显示，5、10、20、40μmol/L的2-ME作用于B16细胞不同时间后对其增殖的抑制作用差异有统计学意义（F=1170.94，P＜0.01）；上述浓度的 2-ME 作用 24、48、72 h，对黑素瘤细胞增殖的抑制作用差异亦有统计学意义（F=1843.04，P＜0.01）；药物浓度和培养时间存在交互作用（F=272.79，P＜0.01）（图1）。2-ME 作用于 B16细胞后，对其增殖产生持续的抑制作用，从第2天开始，2-ME处理组细胞明显减少，生长曲线见图2。

图1 不同浓度2-甲氧基雌二醇（2-ME）对小鼠黑素瘤B16细胞增殖活性的影响

图2 不同浓度2-甲氧基雌二醇（2-ME）对小鼠黑素瘤B16细胞生长曲线的影响

二、2-ME作用后B16细胞的形态学变化

光镜下观察发现，对照组细胞呈贴壁生长，生长状态良好，细胞透明饱满，呈多边形，颗粒较少，细胞间界限清楚；经 10、20、40μmol/L 2-ME 作用48 h后，随着2-ME浓度的增加，变圆、固缩的细胞逐渐增加，呈漂浮状生长的细胞逐渐增多，细胞发生典型的凋亡形态学变化。见图3。

图3 光镜下观察2-甲氧基雌二醇（2-ME）处理小鼠黑素瘤B16细胞48 h后的细胞形态学变化（×200） 3A：对照组细胞；3B～3D：不同浓度 2-ME（10、20、40μmol/L）处理 48 h 后的细胞

三、2-ME对B16细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测发现，对照组B16细胞培养48 h后的凋亡率为（0.23±0.5）%，而10、20、40μmol/L 2-ME处理的凋亡率分别为（4.13±1.12）%、（11.25±2.38）%、（19.46±2.91）%。 随着 2-ME 浓度的增加，B16细胞的凋亡率明显上升，方差分析显示，各处理组及对照组间差异有统计学意义（F=23.10，P＜0.01），两两比较显示，10μmol/L 2-ME处理组与对照组间差异无统计学意义，其余组间两两比较差异有统计学意义（均P＜0.01）。

四、2-ME对B16细胞周期分布的影响

不同浓度2-ME作用于B16细胞48 h后，细胞出现 G0/G1 期阻滞，对照组细胞、10、20、40μmol/L 2-ME处理组细胞G0/G1期比例分别为（44.1±3.4）% 、（59.5±5.6）% 、（63.4±8.2）% 、（70.8±4.4）%，且随着浓度的增加，G0/G1期细胞明显增加，各处理组及对照组间比较，G0/G1期细胞比例差异有统计学意义（F=13.56，P＜0.05），两两比较显示，10μmol/L与20μmol/L 2-ME组间差异无统计学意义，其余组间两两比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 不同浓度2-甲氧基雌二醇（2-ME）作用48 h对小鼠黑素瘤B16细胞周期分布的影响

图5 不同浓度2-甲氧基雌二醇（2-ME）作用小鼠黑素瘤B16细胞24 h对基因表达的影响 5A：逆转录-PCR实验结果；5B：实时定量 PCR 结果。与对照组比较，a：P＜0.01，b：P＜0.05

五、2-ME对gadd45b和c-myc基因表达的影响

作用于B16细胞24 h后，3个实验组及对照组gadd45b基因表达水平比较，差异有统计学意义（F=14.98，P＜0.05）。其中，与对照组比较，20μmol/L 和40μmol/L 2-ME处理组均可明显升高 gadd45b mRNA 的表达（均P＜0.01），而 10μmol/L 2-ME 对其表达没有影响。3个实验组及对照组c-myc基因表达水平比较，差异有统计学意义（F=46.64，P＜0.05）；其中，与对照组比较，10、20、40μmol/L 2-ME均可降低c-myc基因的表达（均P＜0.05），见图5。

讨 论

2-ME是体内17-β雌二醇的代谢产物，研究发现，其可以选择性诱导肿瘤细胞的凋亡，包括多发性骨髓瘤［3］、白血病［4］、食管癌［6］、神经胶质瘤［7］、乳腺癌［8］、结肠癌［9］等，而对正常的细胞不产生影响。目前广泛认同的其抗肿瘤作用机制包括抑制血管生成［10］，导致细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡［11-12］等。Dobos等［13］研究发现，10～50μmol/L 2-ME对8种人黑素瘤细胞的增殖均有抑制作用，可诱导细胞凋亡，导致细胞G2/M周期阻滞，机制可能包括破坏微管、线粒体及激活天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶。我们的研究证实，10～40μmol/L 2-ME对小鼠黑素瘤B16细胞具有增殖抑制作用，且该作用呈时间和浓度依赖性。细胞形态观察结果显示，2-ME具有诱导小鼠黑素瘤B16细胞凋亡的作用，随着2-ME浓度的增加，变圆、固缩的细胞逐渐增加，呈漂浮状生长的细胞逐渐增多，其机制与2-ME诱导恶性黑素瘤细胞凋亡、导致细胞周期阻滞相关。我们还检测凋亡相关蛋白c-myc和gadd45b的表达，发现2-ME能明显下调原癌基因c-myc的表达，使gadd45b表达升高，从而进一步阐述了2-ME的作用机制。我们还发现，40μmol/L 2-ME作用细胞48 h后对其增殖抑制率约40%，细胞凋亡率约为20%，说明2-ME对恶性黑素瘤细胞的增殖抑制作用可能还与其他死亡形式如诱导细胞坏死和自噬有关，尚待进一步的实验研究。

Gadd45家族是DNA损伤修复的重要相关基因，在细胞凋亡和细胞生存中发挥作用。Gadd45基因能够与增殖细胞核抗原（PCNA）结合，从而影响DNA损伤修复，通过细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）/细胞周期蛋白B（cyclin B）复合物及CR6相互作用因子（CRIF1）控制细胞周期，通过调控JNK及P53来抑制细胞生长及促进细胞凋亡过程，并且通过影响NF-κB和JNK之间的通路调控细胞凋亡［14］。Gadd45表达升高，能够明显地抑制肿瘤细胞的生长，主要是通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡实现的［15］，Gadd45基因成为肿瘤治疗的一个新的靶点。本研究结果显示，经2-ME处理过的B16细胞，Gadd45基因的表达升高，证明2-ME能抑制B16细胞的增殖可能与Gadd45基因有关，但尚需深入的实验研究。

C-myc基因是myc基因家族的重要成员，是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族下游的重要蛋白之一，也是一种可使细胞无限增殖获永生化功能并促进细胞分裂的基因，它的表达产物在调节细胞生长、分化中发挥作用［16-17］。本研究发现，2-ME 能下调c-myc基因的表达，说明2-ME对细胞的诱导凋亡作用与c-myc基因的表达有关。

本研究结果显示，2-ME能够明显抑制小鼠黑素瘤B16细胞的增殖，其机制与诱导细胞凋亡及导致细胞周期阻滞有关。2-ME有希望作为一种新的方法用于治疗恶性黑素瘤，但其作用机制尚需深入研究。

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2014-03-06）

（本文编辑：尚淑贤）

Effects of 2-methoxyestradiol on the proliferation and apoptosis of B16 malignant melanoma cells

Hu Caixia*,Zhao Lianmei,Zhang Guoqiang,Tian Fei,Wang Wenqing,Gao Shunqiang.*Department of Dermatology,Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050011,China

Gao Shunqiang,Email:gshunqiang@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the effects of 2-methoxyestradiol （2-ME）on the proliferation and apoptosis of a mouse malignant melanoma cell line B16,and to explore their mechanism.MethodsB16 cells were culturedin vitro,and divided into a negative control group receiving no treatment and several intervention groups treated with 2-ME at final concentrations of 5,10,20,40 mmol/L,respectively.After different durations of treatment,inverted phase-contrast microscopy was conducted to observe the morphologic change of B16 cells,sulforhodamine B（SRB）assay to evaluate proliferative activity and to draw growth curve of B16 cells according to the absorbance value at 490 nm,flow cytometry to detect cell cycle and apoptosis,and reverse transcription PCR and real-time PCR were performed to measure the expressions of the apoptosis-inducing gene gadd45b and proto-oncogene c-myc.ResultsAs repeated measures analysis of variance showed,there were significant differences in the inhibitory effect on B16 cell proliferation among different concentrations（5,10,20,40 mmol/L）and different treatment durations（24,48,72 hours）of 2-ME（F=1170.94,1843.04,respectively,bothP<0.01）,and there was a significant interaction effect between these concentrations and treatment durations （F=272.79,P<0.01）.After 48-hour treatment with 2-ME at 10,20 and 40 mmol/L,the apoptosis rate of B16 cells was increased to （4.13±1.12）%,（11.25±2.380）%and （19.46±2.9）%respectively,compared to （0.23±0.5）%in the negative control group （allP<0.01）;the proportion of B16 cells in G0/G1 phase was increased to（59.5±5.6）%,（63.4±8.2）%and（70.8±4.4）%respectively,compared to（44.1±3.4）%in the negative control group.There was a significant difference in the proportion of B16 cells in G0/G1 phase among the negative control group and intervention groups （F=13.56,P<0.05）.Moreover,the mRNA expression of gadd45b was significantly enhanced after 24-hour treatment with 2-ME at concentrations of 20 and 40 mmol/L（bothP＜0.01）,while that of c-myc was significantly weakened after treatment with 2-ME at 10,20 and 40 mmol/L （all＜0.05）compared with the negative control group.Conclusion 2-ME can inhibit the proliferation of B16 cellsin vitro,upregulate the expression of gadd45b gene and downregulate the expression of C-myc gene.

Estradiol;Melanoma,experimental;Cell line,tumor;Cell proliferation;Apoptosis;Genes,myc;Gadd45 gene

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.03.006

河北省卫生厅医学科学研究课题（20130252）

050011石家庄，河北医科大学第四医院皮肤科（胡彩霞、张国强、王文氢、高顺强），科研中心（赵连梅）；河北省邢台市人民医院皮肤科（田菲）

高顺强，Email：gshunqiang@medmail.com.cn