李文莉，缪冶炼，陈介余，花卫俊，邵慧丽，许 琳

（1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.日本秋田县立大学 生物资源学部，秋田010-0195，日本；3.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800）

木质素降解物对酿酒酵母的毒性

李文莉1，缪冶炼1，陈介余2，花卫俊1，邵慧丽1，许 琳3

（1.南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800；2.日本秋田县立大学 生物资源学部，秋田010-0195，日本；3.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800）

木质素降解物是影响木质纤维素水解液乙醇发酵效率的主要原因之一。为探明木质素降解物对酿酒酵母的毒性，通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.1429的液体培养，测定木质素制剂及酚类化合物（香草醛、紫丁香醇和对羟基苯甲醛）对细胞的毒性，同时分析酚类化合物的联合作用类型，最后以果糖-1，6-二磷酸（FDP）为指标来分析木质素制剂及酚类化合物酵母细胞膜通透性的变化。结果表明：木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的半致死质量浓度分别为10.96、5.37、6.17和7.08 g/L。随着各酚类化合物浓度和种类的增加，它们对细胞的毒性随之增加，呈正协同作用。在培养液中，FDP浓度随各酚类化合物浓度的增加呈线性增加，当各酚类化合物的质量浓度从1.58 g/L增加到10.00 g/L时，FDP质量浓度从49.7 mg/L增加到134.4 mg/L。木质素降解物对酿酒酵母的毒性作用与细胞膜通透性的改变密切相关。

生物乙醇；木质素；酿酒酵母；毒性；果糖-1，6-二磷酸（FDP）

农业秸秆、废弃木材等木质纤维素材料来源广泛、成本低廉、可以再生，因此，以木质纤维素材料为原料的生物乙醇生产技术具有巨大的产业化发展潜力［1］。

以木质纤维素材料为原料的生物乙醇生产过程一般包括原料预处理、酶解、乙醇发酵和乙醇精制等主要步骤［2］。在预处理以及酶解过程中，木质素会降解成相对分子质量不同的物质，其一部分残留在酶解液中。木质素降解产物主要有阿魏酸、香草酸、对羟基苯甲醛及香草醛等酚类化合物［3］。当发酵液中各酚类化合物的质量浓度为1.0 g/L时，阿魏酸对假丝酵母（C.beijerinckii）BA10的致死率为70%，香草酸为64%，对羟基苯甲醛为66%，香草醛为22%。当阿魏酸的质量浓度为0.3 g/L时，假丝酵母（C.beijerinckii）BA10发酵过程中只产生很少量的丙酮丁醇乙醇（ABE），甚至不产生ABE［4］。由此可知，酚类化合物对微生物的毒性是影响木质纤维素水解液发酵的主要原因之一［3-6］。去除木质素降解物毒性的方法有2种：一是对木质纤维素水解液进行脱毒处理，二是培育木质素耐受性菌株。酚类化合物对微生物，特别是对酿酒酵母的毒性大小及其作用机制目前尚不清楚。

木质素是由愈创木基结构、紫丁香基结构和对羟苯基结构等3种单体组成的［7］。在木质纤维素预处理及酶解过程中，木质素会分解成由3种单体组成、相对分子质量不同的化合物。因为香草醛、紫丁香醇、对羟基苯甲醛分别与3种木质素组成单体的结构相类似，所以本研究中笔者选用紫丁香醇、对羟基苯甲醛及香草醛作为模型酚类化合物来研究木质素降解物对酵母细胞的毒性。图1为紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的结构。

图1 紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的结构示意Fig.1 Molecular structure diagram of lilac alcohol，p-hydroxy benzaldehyde and vanilla aldehyde

本文旨在探明木质素降解物对酿酒酵母的毒性及作用机制，为开发木质素脱毒技术以及培育木质素耐受酵母提供理论和技术依据。通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.1429的液体培养，测定木质素制剂及酚类化合物（香草醛、紫丁香醇、对羟基苯甲醛）的毒性，分析酚类化合物的联合作用类型。然后在此基础上，讨论酵母细胞膜通透性的变化。

1 材料与方法

1.1 菌种

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）CGMCC 2.1429购自中国普通微生物保藏中心。菌种的活化方法：用无菌水溶解冻干菌种制成菌悬液，接种至平板活化培养基（葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、琼脂20 g/L，自然pH），在30℃、180 r/min下培养12 h。

1.2 培养基

培养基（g/L）：葡萄糖10，酵母膏8.5，NH4Cl 1.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.06；pH 4.8。

1.3 木质素制剂及酚类化合物

木质素制剂，日本关东化学株式会社；对羟基苯甲醛（纯度＞98%）、香草醛（纯度＞98%），阿拉丁化学有限公司；紫丁香醇（纯度＞98%），东京化成工业株式会社。

1.4 试剂与仪器

醋酸钡（纯度＞99%），上海泗联化工有限公司；间苯二酚（纯度＞99.5%）、硫脲（纯度＞99%）、冰醋酸（纯度＞99.5%）、FDP（纯度＞99.5%），阿拉丁化学有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

752S型紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；BMX-30R型高压蒸汽灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；THZ-D型恒温振荡器，太仓市实验设备厂；DLL.203XP型透射式偏光显微镜，南京市东利来光电有限责任公司；TGL-18C-C型高速离心机，上海安亭科学仪器有限公司。

1.5 木质素制剂及酚类化合物的毒性测定

1.5.1 木质素制剂及单一酚类化合物的毒性测定

将活化后的菌株接入100 mL培养基中，30℃、180 r/min培养20 h至细胞生长稳定期。取0.1 mL的培养液，稀释40倍，用血球计数板测定培养液中的活菌数A。然后，分别加入一定浓度的木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛，继续培养24 h，测定活菌数A*。按照式（1）计算细胞死亡率D。

木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的质量浓度按照对数间距设定为 100.2、100.4、100.6、100.8、101.0和101.1g/L。每个浓度设置2个平行组，每个样品测定3次，取平均值。在本实验的浓度范围内，木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛都是可溶的。

1.5.2 混合酚类化合物的毒性测定

根据预实验结果，按照等质量浓度比配将紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛制成三组二元混合物和一组三元混合物，溶解在培养基中。各成分的质量浓度设定为 100.1、100.2、100.4、100.6和 100.8g/L。每个浓度设置2个平行组，每个样品测定3次，取平均值。

1.6 培养液中果糖-1，6-二磷酸（FDP）的测定

培养液中果糖-1，6-二磷酸（FDP）浓度采用间苯二酚法［8］测定。按照混合酚类化合物毒性测定方法培养酵母细胞。

2 结果与讨论

2.1 木质素制剂的毒性

通过凝胶渗透色谱法测定得知：该木质素制剂的相对分子质量分布为350～34 000，相对分子质量5 000的累积质量分数为50.3%［9］。木质素制剂中的小分子为单一酚类化合物，如阿魏酸、对香豆酸［4］、香草醛［10］、对羟基苯甲醛、丁香醛（3，5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸）和紫丁香醇［11］等。木质素制剂中的大分子为这些酚类化合物的聚合物。

图2表示细胞死亡率随培养液中木质素制剂浓度的变化。细胞死亡率（D）随木质素制剂浓度的增加呈线性增加，其回归方程式见式（2）。

式中：ρL为木质素制剂质量浓度，g/L。

当木质素制剂质量浓度从1.58 g/L增加到12.59 g/L时，细胞死亡率从7.8%上升到53.2%。从回归方程式（2）可知，当细胞死亡率为50%时，lg［ρL/（g·L-1）］=1.04，即木质素制剂的半致死质量浓度（LC50）为10.96 g/L。由此可知，木质素降解物对酵母细胞的毒性作用是多种单一酚类化合物及其聚合物共同作用的结果。

图2 细胞死亡率随培养液中木质素制剂质量浓度的变化Fig.2 Change of cell death rate with the mass concentration of lignin preparation in culture medium

2.2 单一酚类化合物的毒性

图3为细胞死亡率随培养液中紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛浓度的变化。图3中培养液仅仅含有单一酚类化合物。细胞死亡率随培养液中紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛浓度的增加呈线性增加，其回归方程式分别如下见式（3）～式（5）。

式中：DLA、DHB和DVA分别表示培养液中紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛对应的细胞死亡率；ρLA、ρHB和ρVA分别为紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的质量浓度，g/L。

图3 细胞死亡率随培养液中紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛质量浓度的变化Fig.3 Changes of cell death rate with the mass concentration of lilac alcohol，p-hydroxy benzaldehyde and vanilla aldehyde in culture medium

当紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛质量浓度从1.58 g/L增加到10.00 g/L时，紫丁香醇使得细胞的死亡率从13.8%上升到68.8%，对羟基苯甲醛使得细胞的死亡率从7.2%上升到65.2%，香草醛使得细胞的死亡率从7.4%上升到59.9%。此外，从回归方程式（3）～（5）可知，当细胞死亡率 D= 50%时，lg ρLA=0.73，lg ρHB=0.79，lg ρVA=0.85，即紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛的半致死质量浓度（LC50）分别为5.37、6.17和7.08 g/L。3种酚类化合物中，紫丁香醇对酵母的毒性最大，对羟基苯甲醛次之，香草醛最弱。

决定酚类化合物毒性的主要因素有2个。首先，酚类化合物对酵母细胞的毒性与其自身的疏水性密切相关［12-13］。酚类化合物的疏水基团与细胞膜的疏水成分相互作用，从而改变了细胞膜中各成分比例，破坏细胞膜的完整性，这是其对细胞产生毒性的主要原因。另外，酵母细胞自身对酚类化合物的分解作用也是决定其毒性大小的重要因素。在一定的浓度范围内，酵母细胞可以将酚类化合物分解为毒性较弱酸或醇［14-15］。有些酵母细胞中还含有芳香酸脱羧酶（PAD），它可以将对香豆酸、肉桂酸、阿魏酸等酚类化合物分解，从而降低它们的毒性［16］。

由于醛基是亲水性基团，因此不含醛基的酚类化合物的疏水性比含醛基的酚类化合物的疏水性强［17］。疏水性较强的酚类化合物更容易与酵母细胞膜结合，并与细胞膜上的疏水性成分相互作用，从而更大程度上破坏细胞膜的完整性。香草醛和对羟基苯甲醛的分子结构中都有醛基连接在苯环上，而紫丁香醇的苯环结构上没有醛基，也就是说在3种酚类化合物中，紫丁香醇的疏水性最强，毒性也最大。这与实验值相一致。

另外，与香草醛相比，对羟基苯甲醛毒性较大的原因可能是由于酵母细胞分解香草醛的能力较强，而分解对羟基苯甲醛的能力较弱。将一定浓度的香草醛、对羟基苯甲醛加入到含有假丝酵母C.athensensis SB18的液体培养基中，在30℃、150 r/min下培养48 h，定时取样来测定培养液中香草醛、对羟基苯甲醛的残留量。当香草醛、对羟基苯甲醛的初始质量浓度为0.5 g/L时，连续培养39 h后，对羟基苯甲醛和香草醛几乎完全被假丝酵母分解掉，但是酵母细胞分解对羟基苯甲醛的速度小于分解香草醛的速度［18］。因此，在相同时间内，对羟基苯甲醛首先在细胞内部积累，并且积累量大于香草醛，从而使得对羟基苯甲醛对酵母细胞的毒性大于香草醛。

2.3 混合酚类化合物的联合作用

图4表示培养液含有二元酚类化合物时细胞死亡率随各酚类化合物浓度的变化。图5表示培养液含有三元酚类化合物时细胞死亡率随各酚类化合物浓度的变化。细胞死亡率随各酚类化合物浓度的增加呈线性增加，其回归方程式见式（6）～式（9）。

式中：DLH表示含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛的培养液对应的细胞死亡率；ρLH表示含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛的培养液中各酚类化合物的质量浓度，g/L；DLV表示含有紫丁香醇和香草醛的培养液对应的细胞死亡率；ρLV表示含有紫丁香醇和香草醛的培养液中各酚类化合物的质量浓度，g/L；DHV表示含有对羟基苯甲醛和香草醛的培养液对应的细胞死亡率；ρHV表示含有对羟基苯甲醛和香草醛的培养液中各酚类化合物的质量浓度，g/L；DLHV表示含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液对应的细胞死亡率；ρLHV表示含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液中各酚类化合物的质量浓度，g/L。

图4 培养液含有二元酚类化合物时细胞死亡率随各酚类化合物质量浓度的变化Fig.4 Change of cell death rate with the mass concentration of each phenolic compound when the culture medium contains two phenolic compounds

图5 培养液含有三元酚类化合物时细胞死亡率随各酚类化合物质量浓度的变化Fig.5 Change of cell death rate with the mass concentration of each phenolic compound when the culture medium contains three phenolic compounds

各酚类化合物质量浓度从1.00 g/L增加到6.31 g/L时，含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛的培养液中，细胞死亡率从35.3%上升到88.7%，含有紫丁香醇和香草醛、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液中，细胞死亡率分别从 31.1%、26.7%上升到84.2%、75.9%；含有三元混合物的培养液中，细胞死亡率从 45.1%上升到 100%。从回归方程式（6）～（9）可知，细胞死亡率为50%时，lg ρLH=0.29， lg ρLV=0.35，lg ρHV=0.43，lg ρLHV=0.16，含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛、紫丁香醇和香草醛、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液中，各酚类化合物的半致死质量浓度（LC50）分别为1.95、2.24和2.69 g/L；含有三元混合物的培养液中，各酚类化合物的半致死质量浓度（LC50）为1.44 g/L。

培养液中酚类化合物的联合作用类型采用相加指数法（addition index，AI）进行判别［19-20］

式中：Am、Bm和Cm分别表示培养液中各酚类化合物联合作用时的LC50（等浓度配比时，Am=Bm=Cm）；Ai、Bi和Ci分别表示不同酚类化合物单独作用时的LC50；S表示毒性相加作用。

由S来求相加指数AI：当S≥1时，AI=-S+1；当S＜1时，AI=1/S-1。

根据AI的值来判别混合酚类化合物的作用类型：AI＞0时，联合作用的类型为协同作用；AI=0时，为简单相加作用；AI＜0时，为拮抗作用。

表1表示培养液中酚类化合物的联合作用类型。紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛单独作用时的半致死质量浓度分别为5.37、6.17和7.08 g/L；含有紫丁香醇和对羟基苯甲醛、紫丁香醇和香草醛、对羟基苯甲醛和香草醛组的培养液中各酚类化合物的半致死质量浓度分别为1.95、2.24和2.69 g/L；含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液中各酚类化合物的半致死质量浓度为1.44 g/L。半致死浓度越小，表示该酚类化合物的毒性越大。由此可知，各酚类化合物在联合作用时的毒性比在单独作用时要大得多。含有紫丁香醇与对羟基苯甲醛、紫丁香醇与香草醛、对羟基苯甲醛与香草醛的培养液AI值分别为0.47、0.37和0.22，由上述判定方法可知，其联合毒性的作用类型均为协同作用。此外，含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的培养液AI值为0.43，其联合作用类型也是协同作用。目前，关于酚类化合物毒性的研究大都只分析了其单独作用时的毒性，本文中笔者对培养液中混合酚类化合物联合毒性类型进行了判别，为开发木质纤维素水解液的高效脱毒技术和木质素耐受菌株的诱变与筛选提供了依据。

表1 培养液中酚类化合物的联合作用类型Table 1 Combined effect of phenolic compounds in culture medium

2.4 木质素降解物对酵母的毒性作用机制

图6表示细胞死亡率、培养液中胞内果糖-1，6-二磷酸（FDP）浓度随各酚类化合物浓度的变化。在含有紫丁香醇、对羟基苯甲醛、香草醛的培养液中，当各酚类化合物的质量浓度在1.58～6.31 g/L时，细胞死亡率和培养液中FDP浓度均随其浓度呈线性增加。当各酚类化合物的质量浓度为1.58 g/L时，细胞死亡率、FDP的质量浓度分别为52.7%和49.7 mg/L；当各酚类化合物质量浓度为6.31 g/L时，细胞死亡率达到100%，FDP的质量浓度增加到112.2 mg/L。此外，当各酚类化合物的质量浓度从6.31 g/L增加到10.00 g/L时，细胞死亡率维持在100%，而FDP的质量浓度从112.2 mg/L进一步增加到了134.4 mg/L。

图6 细胞死亡率和培养液中FDP质量浓度随各酚类化合物质量浓度的变化Fig.6 Changes of cell death rate and FDP concentration in culture medium with the logarithmic concentration of each phenolic compound

细胞死亡的原因有2种。一是细胞坏死，它是指细胞受到环境因素的影响，导致细胞死亡的过程。二是细胞凋亡，即细胞发生主动的、由基因控制的自我消亡过程。细胞死亡伴随着细胞膜通透性改变、代谢停止、结构破坏和功能丧失等不可逆性变化。本研究中酵母细胞的液体培养时间为44 h，酵母细胞生长处于稳定期，并且针对含有毒性成分的培养液设定了对照组，避免了细胞凋亡，因此可以认为细胞死亡是由于木质素降解物对细胞的毒性作用而导致的。

正常的酵母细胞中，果糖-1，6-二磷酸（FDP）不断参与代谢反应，并且由于细胞膜的选择透过性，FDP不能渗透到细胞外。然而，当细胞膜的通透性发生改变，或者细胞膜被破坏时，FDP会流到细胞外，从而使得培养液中FDP的浓度升高［21］。卢群等［22］在研究超声波对酵母细胞膜通透性的影响时，用FDP浓度的增加量来直观反映细胞膜通透性的改变。实验过程中利用不同强度的超声波对发酵液进行处理，测定细胞死亡率及FDP浓度的增加量。400、500和600 W超声波处理225 s后，细胞死亡率分别为12%、15%和36%，FDP的浓度分别增加了30%、55%和120%。随着酵母细胞死亡率的增加，培养液中FDP的浓度也逐渐增加，即细胞膜的通透性逐渐增大。本研究中，从图6可以看出，培养液中FDP的浓度与细胞死亡率呈正相关。这表明，木质素降解物对酵母细胞的毒性作用与细胞膜通透性的改变密切相关。

3 结论

通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，CGMCC 2.1429）的液体培养，测定了木质素制剂及酚类化合物（香草醛、紫丁香醇和对羟基苯甲醛）对酵母细胞的毒性，分析了酚类化合物的联合作用类型，讨论了细胞膜通透性的改变。木质素制剂、紫丁香醇、对羟基苯甲醛和香草醛的半致死质量浓度分别为10.96、5.37、6.17和7.08 g/L。酚类化合物具有协同作用。培养液中，果糖-1，6-二磷酸（FDP）浓度随酚类化合物浓度的增加呈线性增加。当各酚类化合物的质量浓度从1.58 g/L增加到10.00 g/L时，FDP质量浓度从 49.7 mg/L增加到 134.4 mg/L。木质素降解物对酿酒酵母的毒性作用与细胞膜通透性的改变密切相关。

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（责任编辑 管 珺）

Inhibition of lignin degradation products on Saccharomyces cerevisiae

LI Wenli1，MIAO Yelian1，CHEN Jieyu2，HUA Weijun1，SHAO Huili1，XU Lin3
（1.College of Food and Light Industrial Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China；2.Faculty of Bioresource Science，Akita Prefectural University，Akita 010-0195，Japan；3.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800，China）

Lignin degradation products are main inhibitors that restrain the ethanol production by fermentation of lignocellulosic hydrolysate.The objective of the present study was to clarify the inhibition of lignin degradation products on Saccharomyces cerevisiae.The toxicity of lignin preparation and phenolic compounds such as vanilla aldehyde，lilac alcohol，and p-hydroxy benzaldehyde was measured by culturing Saccharomyces cerevisiae CGMCC 2.1429.Then，the change of cell membrane permeability was evaluated by the concentration of fructose-1，6-diphosphate（FDP）.Results show that the 50%lethal concentration（LC50）of lignin preparation，vanilla aldehyde，lilac alcohol，and p-hydroxy benzaldehyde was 10.96，5.37，6.17 and 7.08 g/L，respectively.All the phenolic compounds acted synergistically on yeast cells. Fructose-1，6-diphosphate（FDP）concentration in culture medium increased linearly with increasing logarithmic concentration of each phenolic compound.When the concentration of each phenolic compound increased from 1.58 g/L to 10.00 g/L，FDP concentration increased from 49.7 mg/L to 134.4 mg/L.The toxicity of lignin degradation products on Saccharomyces cerevisiae closely related to the change of cell membrane permeability.

ethanol；lignin；Saccharomyces cerevisiae；toxicity；fructose-1，6-diphosphate（FDP）

TQ352.78

A

1672-3678（2015）01-0082-07

10.3969/j.issn.1672-3678.2015.01.014

2013-06-04

国家重点基础研究发展计划（973计划）（2011CBA00807）；国家高技术研究发展计划（863计划）（2012AA022101）

李文莉（1988—），女，江苏徐州人，硕士研究生，研究方向：生物能源；缪冶炼（联系人），教授，E-mail：ylmiao@njtech.edu.cn