何之龙 詹亚光

摘要 [目的]探讨水曲柳CBF基因的表达及与生物钟调控的关系。[方法] 利用cDNA 末端快速克隆（RACE）技术克隆水曲柳CBF1基因的全长序列，并对三年生水曲柳幼苗叶片中FmCBF1基因的时间表达特征进行初步研究。[结果]利用RNA末端快速扩增（RACE）的方法从水曲柳中克隆得到1个CBF基因家族成员FmCBF1 （GenBank： KJ541508.1），该基因ORF 669bp，推测编码蛋白质含有222个氨基酸残基，相对分子质量24.5 kD，理论等电点为5.11，在DNA序列内不含内含子。氨基酸序列同源性比较发现，水曲柳FmCBF1基因与白桦BpCBF1同源性最高，相似性达79.4%，在系统进化树中处于同一分支上。实时荧光定量PCR表达特性分析显示， FmCBF1基因的表达具有一个大约以24 h为周期的节律性，最大值约出现在9：00，而夜间却处于较低的表达水平。在4 ℃低温处理1、3、6、12、24、72和120 h后FmCBF1的qRTPCR分析表明，该基因受到低温诱导，并在4 ℃条件下随低温时间的延长，该基因的诱导表达特性呈先升后降的趋势，最大值出现在12h时，达对照的25.5倍。[结论]为进一步研究水曲柳抗旱耐寒性及分子育种奠定基础。

关键词 水曲柳 ；基因克隆；CBF；昼夜节律

中图分类号 S718.46 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-015-06

Cloning and Expression Analysis of FmCBF1 Genes from Fraxinus mandschurica

HE Zhilong1， ZHAN Yaguang1，2*， ZENG Fansuo1，2

（1. Life Science College， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040；2. National Key Laboratory of Forest Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] The aim was to investigate the relationship between expression of FmCBF1 Genes from Fraxinus mandschurica

and clock control.[Method] FmCBF1 was cloned from Fraxinus mandschurica seedlings by rapid amplification of cDNA ends （RACE）. [Result] FmCBF1 contained a 669 bp complete open reading frame （ORF） which encoded a peptide of 222 amino acids. The predicted molecular weight and isoelctric point of FmCBF1 were 25.5 kD and 5.11， respectively. There was no intron in the DNA sequence of FmCBF1. The results of homology comparison showed that FmCBF1 protein shared 79.4% homology with Betula platyphylla BpCBF1， they were in the same branch in the phylogenetic tree. Expression analysis showed that the transcript level of CBF1 oscillated with a peak occurring at about 9 oclock in the morning followed by a second peak about 24 h later. Time course of the genes expressions at 4 ℃ for 1， 3， 6 12， 24， 72 and 120 h showed that its expression increased at the first and then decreased， and its peak occurring at 12 h after the callus was moved to 4℃ stress， and its expression was 25.5 times higher than CK.[Conclusion] The study laid foundation for study on drought cold and molecular breeding of Fraxinus mandschurica.

Key words Fraxinus mandschurica； Cloning； CBF； Circadian

基金項目 国家林业科技支撑项目（2011BAD0213）；国家自然科学基金项目（31270697）。

作者简介 何之龙（1988- ），男，湖南株洲人，博士研究生，研究方向：植物基因工程。

*通讯作者。

收稿日期 20141222

干旱响应元件（Crepeat/dehydration responsive element，CRT/DRE）是一种植物中DNA调控的顺式作用元件，它位于COR（coldregulated）以及其他一些受低温诱导基因的启动子上，能刺激低温和水分缺失下的转录起始[1]。CBF/DREB1蛋白是DNA结合蛋白AP/EREBP家族中的一种转录激活因子，研究发现，在逆境条件下CBF/DREB1转录因子能有效地与CRT/DRE结合，并激活其下游COR基因的转录，从而提高植物抵抗低温、干旱以及高盐等非生物胁迫的能力[2]。……