柴松 安文婷 郭丽丽 姜乐 高志嵩 李书军

长链非编码RNA（long non-coding RNA, lnc RNA）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，在人类全基因组中有20万-40万种不同的lnc RNA。研究[1]表明lnc RNA可以通过多种方式影响编码基因的表达，在肿瘤的发生发展过程中起调控作用。SPRY4内含子转录本1（SPRY4 intronic transcript 1, SPRY4-IT1）（基因号AK024556）是转录自SPRY4基因的第二个内含子的长度为687个核苷酸的未剪接的、多聚腺苷酸化的转录产物，最初在脂肪组织中得以鉴定，且过表达SPRY4-IT1在黑色素瘤中具有促进细胞生长、迁移和侵袭的作用[2]，然而其在肺癌细胞中的作用尚未报道。本研究拟探讨SPRY4-IT1对肺癌细胞A549侵袭和迁移能力的影响，并初步探索可能的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺癌细胞系A549、95C、95D、Calu-3、H125、H1299、H1975、SPC-A1由河北医科大学第二医院肿瘤中心提供；抗基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2抗体、抗MMP-9抗体均购自武汉博士德生物有限公司；Transwell（8 μm孔径）小室及Matrigel胶购自北京乐博生物科技有限公司，实验中所用引物由广州锐博生物有限公司设计并合成，检测SPRY4-IT1在肺癌A549细胞中的表达，RT-PCR上游引物为5'-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3'，下游引物为5'-CGATGTAGTAGGATTCCTTT-CA-3'，GAPDH上游引物为: 5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3'，GAPDH下游引物为: 5'-AGAGGCA-GGGATGATGTTCTG-3'。

1.2 基因全长序列克隆 根据GenBank数据库SPRY4-IT1标准序列NR-002196.1设计引物，上游引物5'-TAAGCTTGTAGAGATGGGGGTTTCATCCTGTTGG-3'，下游引物5'-ACTCGAGAAAGACTCCCTTTCCTTAAGCAGATTCAC-3’，循环条件：93oC预变性1 min，93oC变性30 s，65oC退火30 s，72oC延伸2 min，25个循环，72oC终末延伸5 min，产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物并进行产物纯化回收，将产物连接T载体后，转化DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白色克隆，扩增后进行酶切鉴定，同时送测序分析证实扩增片段的正确性。

1.3 构建真核表达载体 双酶切pcDNA3.1载体和插入正确片段的T质粒，分别纯化回收目的片段。……