朱　翔，路文明，丁宁玲，叶建中，王　锋，沙　莉，李　扬，高胜兰

截短序列和全序列HBcAg基因以及HBV C-S融合基因的克隆与表达*

朱翔，路文明，丁宁玲，叶建中，王锋，沙莉，李扬，高胜兰

【摘要】目的构建截短序列和全序列HBcAg基因和HBc-HBsAg融合基因原核表达质粒，研究目的蛋白在大肠杆菌中的表达及其免疫原性。方法利用HBV全基因（adr亚型）质粒pUCmT-HBV分别扩增HBsAg截短基因、HBcAg截短基因和HBcAg全基因，构建成重组质粒pSK-HBs、pSK-HBc和pKS-HBV C，经DNA序列测定鉴定后，分别将HBcAg截短基因、HBcAg全基因及HBc-HBsAg融合基因亚克隆至表达质粒PET-30a，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达HBcAg截短基因、HBcAg全基因和HBc-HBsAg融合基因产物，采用PAGE-SDS和免疫印迹法对表达产物进行鉴定。结果成功构建了含HBcAg截短基因、HBcAg全基因和HBc-HBsAg融合基因的原核表达质粒；成功构建的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中能大量表达HBcAg蛋白和HBc-HBsAg融合蛋白，免疫印迹分析结果显示表达产物具有免疫原性。结论成功构建的原核表达载体在大肠杆菌BL21（DE3）中能顺利表达HBcAg蛋白和HBc-HBsAg融合蛋白，表达产物具有免疫原性，为慢性乙型肝炎特异性免疫治疗研究提供了实验基础。

【关键词】乙型肝炎病毒；HBsAg；HBcAg；融合蛋白；原核表达质粒

本实验将HBV核心抗原与表面抗原部分基因在原核细胞中融合表达，并对其抗原性进行分析，为进一步研究慢性乙型肝炎特异性免疫治疗奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌种与质粒大肠杆菌XL1-Blue及质粒pBlue-scriptIISK（-）购自Stratagene公司；大肠杆菌菌株BL21（DE3）和表达载体pET-30a购自EMD Biosciences，Inc.Novagen Brand。含HBsAg全基因和HBcAg全基因（adr亚型）的质粒pUCmT-HBV由本实验室保存。

第一作者：朱翔，男，医学博士，主任医师，教授。E-mail：szzhuxiang@hotmail.com

1.2酶及主要试剂分子克隆所用限制性内切核酸酶BamHI、HindIII、EcoRI、NcoI、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购于 Pharmacia公司；DNA分子标准（DL2，000）、分子蛋白质（Broad）标准（Code No：D532S）和 dNTP购 于TaKaRa公司；IPTG、X-gal、玻璃珠（Silver Beads）DNA胶回收试剂盒和辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体购于Sangon公司。

1.3PCR引物设计与合成参照HBsAg和HBcAg基因（adr亚型）序列，设计出6条引物，交由上海Sangon公司合成。分别为扩增编码截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和全序列HBcAg基因。扩增编码含截短HBsAg片段（约 150 bp）的PCR上下游引物S1和S2设 计 如 下 ，S1：5’-GGGGATCCTGTCTTGCGGCGTTTTATC-3’，此引物被引入了BamHI识别位点；S2：5’-CCCAAGCTTCTAGGTCTTGCATGGTCCCGT-3’，此引物被引入终止密码子和 HindIII识别位点。扩增编码截短的HBcAg片段（约460 bp）的PCR上下游引物C1和C2设计如下，C1：5’-GGAATTCCATGGACATTGACCCGTATAAAG-3’，此引物被引入了EcoRI和 NcoI别位点；C1：5’-GGAATTCCATGGACATTGACCGTATAAAG-3’，此引物被引入了EcoRI和NcoI别位点。扩增编码全序列HBcAg基因片段（约560bp）引物设计如下，CC1：5’-GGGATCCCATATGGACATTGACCCGTATAAAG-3’，此引物被引入了BamHI和NdeI识别位点；CC2：5’-CCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAG-3’，此引物被引入了Hind III识别位点。

1.4目的基因的PCR扩增分别用三对引物从pUCmT-HBV质粒上扩增出截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和全序列HBcAg基因。分别将截短的HBsAg基因、截短的HBcAg基因和全序列HBcAg基因扩增片段回收，分别用相应的限制性内切酶于37℃进行双酶切4 h，双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，切下目的条带，用玻璃珠DNA胶回收试剂盒纯化回收DNA，并以相应的酶切位点导入pBluescriptIISK（-）载体，回收产物用T4连接酶16℃连接过夜。取连接产物转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，涂布氨苄青霉素和卡那霉素抗性平板，37℃培养过夜。在双抗筛选平板生长的单菌落提取质粒，PCR扩增鉴定是否有阳性克隆。将PCR阳性克隆质粒进一步经双酶切鉴定。用引物S1、S2从pUCmT-HBV质粒上扩增HBs片段（约 150 bp），用BamHI和Hind III克隆到pSK质粒上，称为 pSK-HBs。用引物 C1、C2从pUCmT-HBV质粒上扩增截短的HBc基因编码蛋白N端150个氨基酸的基因片段（约460 bp），用EcoRI 和BamHI克隆到pBluescriptIIKS（-）质粒上，称为pKS-HBc。用引物CC1、CC2从pUCmT-HBV质粒上扩增全序列HBcAg基因片段（约560bp），用BamHI 和HindIII酶切，克隆到pBluescriptIIKS（-）质粒上，称为pKS-HBV C。由英骏生物技术有限公司进行DNA测序分析。

1.5表达质粒的构建将测序正确的克隆用相应的内切酶克隆到pET-30a质粒上，得到不同的表达质粒。①表达质粒pET-HBs的构建：将质粒pKS-HBs用BamHI和HindIII克隆到质粒pET-30a上的相应位点上，称为pET-HBs；②表达质粒pET-HBc的构建：将质粒pKS-HBc用NcoI和BamHI酶切，得到的460 bp片段克隆到 pET-30a的相应位点上，称为pET-HBc；③表达质粒pET-HBV C的构建：质粒pKS-HBV C用NdeI和HindIII酶切，酶切得到约560 bp的DNA片段克隆到 pET-30a质粒上，得到的表达质粒能够表达不带组氨酰残基的天然HBV C基因蛋白；④融合蛋白表达质粒pET-HBc-HBs的构建：质粒pKS-HBs用BamHI和HindIII酶切，得到的150 bp片段克隆到pET-HBc的相应位点上，最终得到含HBc和HBs的融合蛋白表达质粒，称为pET-HBc-HBs。

1.6表达质粒 pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pET-HBc-HBs在大肠杆菌中的表达

1.6.1表达质粒的转化将表达质粒 pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pET-HBc-HBs转化，用氯化钙处理法得到的感受态大肠杆菌BL21（DE3）菌株，将菌株涂于LB平板上，置37℃培养箱。

1.6.2在大肠杆菌中的表达在37℃振荡培养至OD600nm约为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为1mM，再培养5h后离心，收集菌体，加入上样缓冲液（4%SDS，2%β-巯基乙醇，4%甘油，0.1%溴芬蓝，50 mMTris-HCL，pH 6.8）100℃处理5 min，离心，去除细菌碎片，保存上清液。

1.6.3表达蛋白的检测诱导的细胞经上述处理后，取20μl上清，进行SDS-PAGE分析（分离胶浓度为12%）。按分子克隆所述方法，通过电转移将凝胶中的抗原转移到硝酸纤维膜上，以HBsAb和HBcAb阳性血清（来自我院1例CHB患者）作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗人抗体为二抗（工作浓度为1∶1000），DAB（0.6g/L）显色，进行Western blot免疫印迹分析，判断表达蛋白的免疫原性。

2　结果

2.1截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和HBcAg全基因序列的PCR扩增和表达质粒构建成功应用我们设计的三对引物分别从质粒pUCmT-HBV上扩增出截短HBsAg基因、截短HBcAg基因和HBcAg全部基因片段，得到长度分别为150 bp、460 bp和560 bp的DNA片段。将纯化后的PCR产物连接到质粒pBluescriptIISK（-）上，构成pSK-HBs、pSK-HBc和pSK-HBV C重组质粒。随后将该重组质粒进行PCR鉴定（图1），把该质粒送到联合基因公司进行测序，结果与我们设计引物区间内的HBV基因（adr亚型）完全一致。在测序正确后，用相应的内切酶从pSKHBs、pSK-HBc和pSK-HBV C质粒上将目的DNA片段切出，连接到pET-30a质粒上，构建成表达质粒pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pET-HBc-HBs，以PCR进行鉴定（图2）。

图1　重组质粒pSK-HBV C、pSK-HBc和pSK-HBs的PCR鉴定结果

M：DNA Marker DL2，000；1：从质粒pSK-HBV C扩增出PCR产物；2：从质粒pSK-HBc扩增出PCR产物；3：从质粒pSK-HBs扩增出PCR产物

图2　表达质粒pET-HBs、pET-HBc、pET-HBV C和pETHBc-HBs PCR鉴定结果

M：DNA Marker DL2，000；1：以引物 S1和 S2从质粒pET-HBs扩增出PCR产物；2：以引物 C1和C2从质粒pET-HBc扩增出PCR产物；3：以引物CC1和CC2从质粒pET-HBV C扩增出PCR产物；4：以引物C1和S2从质粒pET-HBc-HBs扩增出PCR产物

2.2融合蛋白表达成功按分子克隆所述方法，检测截短HBsAg、截短 HBcAg、HBcAg全基因蛋白和HBc-HBsAg融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达，在SDS-PAGE凝胶电泳图（图3、图4）上出现不同的表达情况，截短HBsAg基因在大肠杆菌BL21（DE3）中未见表达，截短HBcAg基因在大肠杆菌BL21（DE3）中大量表达，与推测的蛋白分子量和DNA片段长度结果基本一致（编码 HBcAg的前150个氨基酸，约为27 kDa，约460 bp），其表达蛋白约占大肠杆菌总蛋白的50%；HBV C全基因在大肠杆菌BL21（DE3）中表达量明显减少，与推测的蛋白分子量和DNA片段长度结果基本一致（编码约HBcAg180个氨基酸，560 bp）；HBc-HBsAg融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中也有一定量的表达，与推测的蛋白分子量和DNA片段长度结果基本一致（约610 bp，约为 34 kDa），其融合蛋白约占大肠杆菌总蛋白的10%以下。

图3　截短的HBsAg、截短的HBcAg和HBV C全基因在大肠杆菌中表达产物的PAGE-SDS电泳分析

M：蛋白分子 Marker；1：pET-30a未经 IPTG诱导；2：pET-30a经 IPTG诱导；3：pET-HBs未经 IPTG诱导；4：pET-HBs经 IPTG诱导；5：pET-HBc未经 IPTG诱导；6：pET-HBc经IPTG诱导；7：pET-HBV C未经IPTG诱导；8：pET-HBV C经IPTG诱导

图4　截短的HBsAg、截短的HBcAg和HBc-HBsAg融合基因在大肠杆菌中表达产物的PAGE-SDS电泳分析

M：蛋白分子 Marker；1：pET-30a未经 IPTG诱导；2：pET-30a经 IPTG诱导；3：pET-HBs未经 IPTG诱导：4：pET-HBs经 IPTG诱导；5：pET-HBc未经 IPTG诱导；6：pET-HBc经IPTG诱导；7：HBc-HBsAg经IPTG诱导；8：HBc-HBsAg未经IPTG诱导

2.3表达蛋白的鉴定含重组质粒菌在27 kDa和31kDa处出现阳性反应带，而含空表达质粒菌体在该处无蛋白带，结果表明表达蛋白可以被乙型肝炎病毒HBsAb和HBcAb阳性血清所识别（图5），表达的蛋白具有抗原活性，经纯化后可用于慢性乙型肝炎特异性免疫治疗的基础研究。

图5　 pET-30a、pET-HBc和HBc-HBsAg基因表达产物的鉴定经Western blot免疫印迹分析，应用HBsAb/HBcAb双阳性血清作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗，结果检测出阳性蛋白

M：蛋白分子Marker；1：pET-30a经IPTG诱导；2：HBc-HBsAg经IPTG诱导；3：pET-HBc经IPTG诱导

3　讨论

根据目前文献报道结果，HBV S基因核苷酸只有在酵母菌及真核表达系统才能表达出具有强抗原决定簇的蛋白，其操作繁琐、成本高［1～5］。Hee比较了HBsAg全序列中分别由9～10个氨基酸组成的各种多肽，对从慢性乙型肝炎患者分离出的外周血单个核细胞（PBMC）负载后诱导特异性CLT的结果，其中核酸序列第269～278位所编码抗原多肽LVLLDYQGML介导的HBV特异性CLT反应最强，可替代HBsAg负载介导特异性CLT，简化了实验操作，降低了成本［6～9］。

HBV C基因在不同亚型间均最为保守，在它编码的180多个氨基酸中CTL表位多位于第150位氨基酸以前，其中18～27位AA为HLA-A0201所限制，第88～96位AA被HLA-A11所限制，第88～96 位AA为HLA-A11所限制，第141～150位AA为HLA-Aw68和HLA-A31所限制，第75～81位AA或72～88位AA是很强的构像型B细胞表位。因此，核心抗原是比较理想的疫苗研究靶分子。

免疫学研究证实，HBcAg可以直接激活B细胞。因此，它既是一种T细胞依赖性抗原，又是一种T细胞非依赖性抗原。同时由于它的C末端可以结合少量的核酸，可以使免疫反应向Thl方向极化。乙型肝炎病毒各个基因片段原核表达难易程度不同，考虑到HBV C基因在不同亚型间最为保守，而HBV C全基因原核表达量低。本研究选择截短的HBV C基因前面的450 bp进行表达，构建了原核重组表达质粒pET-HBc，获得了高效表达的目的蛋白，并进一步证实该浓缩蛋白可以与抗HBV阳性血清结合，说明其具有很好的抗原性和特异性。HBc-HBsAg融合表达质粒pET-HBc-HBs含HBcAg前段1～150氨基酸和含编码LVLLDYQGML多肽的HBsAg部分基因片段的复合抗原，使之能够在大肠杆菌中得到表达，并具有HBcAg和HBsAg的抗原性和特异性，复合抗原携带更多的病毒抗原表位，更接近HBV病毒颗粒，遗憾的是其表达量不如单纯截短的HBcAg高，但原核表达成本低，蛋白纯化操作方便，与真核表达相比，获取目的蛋白十分方便，作为复合抗原负载DC介导特异性CTL，可用于针对慢性乙型肝炎的特异性免疫治疗研究。

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（收稿：2014-08-05）

（本文编辑：陈从新）

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.006

*基金项目：苏州市科学技术局科技支撑计划（社会发展）项目（编号：YJS0943）

作者单位：210007江苏省苏州市苏州大学附属传染病医院（苏州巿第五人民医院）

Cloning and expression of truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene in vitroZhu Xiang，Lu Wenming，Ding Ningling，et al.Affiliated Infectious Disease Hospital，Soochow University，Suzhou 210007，Jiangsu Province，China

【Abstract】Objective To construct the prokaryotic recombinant plasmidscarring truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene，and to observe the expression of target proteins in E.coli and their immunogenicity in vitro.Methods Truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene were obtained from plasmid pUCmT-HBV containing whole-length HBV gene（subtype adr）and construct recombinant plasmids of pSK-HBs，pSK-HBc and pKS-HBV C.Truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene which were obtained by fusing truncated HBsAg and truncated HBcAg gene，were subcloned into a expression vector pET-30a respectively after confirmed by DNA sequencing.The gene products were expressed in E.coli BL21（DE3）and identified by SDS-PAGE and Western blot.ResultsThe prokaryotic expression plasmids expressing truncated HBcAg gene，whole-length HBcAg gene and HBc-HBsAg fusion gene were successfully constructed.High levels of HBcAg protein and HBc-HBsAg fusion protein were observed in E.coli BL21（DE3）and their immunogenicity were confirmed by Western blot.Conclusion HBcAg protein and HBc-HBsAg fusion protein are successfully obtained by selected expressing vector in E.coli BL21 （DE3）and the gene products have immunogenicity.This study has provided an experimental basis for specific immunotherapy for chronic hepatitis B.

【Key words】Hepatitis B virus；Hepatitis B surface antigen；Hepatitis B core antigen；Fusion protein；Prokaryotic expression plasmid