陆勇刚 张静敏 孙 维 陶 炯中国福利会国际和平妇幼保健院 （上海 200030）

1例45, X45, X不育症男性的分子遗传学特征

陆勇刚 张静敏 孙 维 陶 炯*
中国福利会国际和平妇幼保健院 （上海 200030）

摘要目的 从1例45, X不育症男性的分子遗传学特征探讨无精子症或少弱精子症患者的遗传缺陷与精子生成障碍的关系，分析部分患者不育原因是否可能与染色体异常有关。方法 采用常规染色体、FISH及分子检测技术，对该患者进行遗传学分析。结果 常规染色体检测显示该患者核型为45,X,dic(Y;13)(q12;p11)。且易位的染色体中只有一个着丝粒具有活性，其中72%的细胞Y染色体着丝粒失活，13号染色体着丝粒收缩，具有活性，其余28%的细胞13号染色体着丝粒失活。FISH与分子遗传学分析证实患者13号短臂增加部分来源于Y染色体，Y断裂位点位于q12异染色质区。近端包括AZF和SRY在内的所有Y常染色体部分与13号染色体短臂融合，形成一条双着丝粒染色体。其13号染色体与Y染色体功能基因区未发生任何缺失。核型描述为45,X,dic(Y;13) (q12;p11).ish(SRY+, DYZ3+, GLP13+)。结论 本例遗传学分析结果提示部分男性不育症可能是由Y/常染色体易位造成减数分裂异常，导致生精受阻，精子生成大量减少而引发不育。

关键词不育, 男性; 45, X男性; 易位, 遗传

男性不育与染色体异常关系密切，发生的比率与精子数量成反比。不育症男性中染色体异常的发生率约为2%～8%，是普通人群中发生染色体异常概率的100倍，无精子症男性中的比率上升至16%[1, 2]。常见的有性染色体数目异常（主要为XXY）和结构异常。

Y染色体易位是一种Y染色体结构异常，目前认为其造成不育的机制可能有两种：其一可能是由于易位引起的Y染色体AZF（azoospermic factor）基因缺失所致。AZF基因定位于Y常染色质q11区，与精子发生相关，其部分或完全缺失可导致精子发生异常[3]。而在AZF基因完整却发生精子缺乏的Y染色体易位人群中，其原因可能与减数分裂时性染色体联会异常有关，形成一个异常的性小体（sex body），最终导致精子发生停止[4]。

45,X是一种特殊的Y染色体易位，通常为Y染色体短臂上性别决定因子SRY基因易位至常染色体上，至今只有30余例报道。本文描述了一例核型为45,X的不育症男性，并通过常规染色体、FISH及分子检测，探讨其不育症发生原因，以及辅助生育的潜在遗传风险。

材料和方法

一、病例

一对夫妇，男30岁，女27岁，因结婚4年不育要求辅助生育。夫妇俩否认家族中有先天性畸形、遗传性疾病史。外生殖器及其他常规体格检查无异常发现。男方精液检查显示为严重少精子，每4～5个低倍视野见0-1个形态较好活动精子。睾丸病理未获得，并不知道其生精情况。

二、常规染色体核型分析

患者外周血淋巴细胞经PHA刺激体外培养，常规制备染色体， G显带、C显带。

三、染色体荧光原位分析（FISHFISH）

我们分别采用SRY/X着丝粒探针与13（GLP13 14）/21号探针以及X/Y（DYZ3）着丝粒探针与18号着丝粒探针对其中期染色体进行杂交。以此判断Y的存在，及其易位形式。

13号染色体长臂q14和21号染色体长臂q22区域特异探针[GLP13（绿色）/GLP21（红色）]以及18、X、Y染色体着丝粒探针[CSP18（湖蓝色）/CSP X（绿色）/CSP Y（红色）]购自北京金菩嘉医疗科技有限公司，Y染色体短臂SRY探针和X着丝粒探针购自美国Vysis公司。FISH检测按公司操作手册，杂交后染色体经DAPI复染后在OLYMPUS BX51正置荧光显微镜下镜检。图像由JENOPTIK（Prog Res MF cool）冷CCD采集，Video Test-Fish 2.0软件分析。

四、AZFAZF基因区的分子检测

为了确定Y染色体断裂位点及AZF的缺失情况，应用Y染色体STS标记进行PCR分析。我们采用酚氯仿抽提法从该患者的外周血淋巴细胞抽取了基因组DNA，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色。选择的STS位点如下：AZYa: SY84、SY86；AZYb: SY124；AZFc: SY157、SY255（DAZ）；异染色质区: SY160。

结 果

一、常规染色体核性分析

患者外周血淋巴细胞经常规染色体制备G显带后，计数50个细胞，所有细胞的染色体数目都为45条，缺少一条性染色体。选取显带分辨率在400～500条带的细胞经过核型配对后发现一条13号染色体与Y染色体发生易位，形成一条双着丝粒染色体。其中28%（14/50）的细胞Y染色体着丝粒收缩，具有活性，13号染色体着丝粒失活（图1A1A），72% （36/50）的细胞Y染色体着丝粒失活，13号染色体着丝粒收缩，具有活性（图1B1B）。C显带未见Y异染色质区（Yqh），Y断裂位点不清楚（图1C1C）。

图1 患者染色体G带和C带核型图

图2 患者染色体核型FISHFISH结果

二、染色体荧光原位分析（FISHFISH）

采用13号染色体长臂q14 的位点特异探针和Y染色体上的SRY探针同时与患者的中期染色体进行杂交，证实13号染色体短臂增加的遗传物质来源于Y染色体，进一步用Y着丝粒探针证实易位的染色体包括了双着丝粒（图2）。结合FISH与常规染色体检测结果，我们可以得出Y长臂断裂后易位至13号染色体短臂，形成一条双着丝粒染色体，其SRY存在。

三、AZFAZF基因区的分子检测

分子检测结果显示SY84、SY86、SY124、SY157、SY255及SY160都存在（图3），Y染色体断裂位点位于q12位置，AZF基因没有任何缺失。

核型为45,X,dic(Y;13)(q12;p11).ish (SRY+, DYZ3+, GLP13+)。

图3 患者AZYAZY基因检测结果

讨 论

本文报告了一例核型为45,X的不育症男性。45, X核型的患者通常为Turner综合征女性，临床表现为身材矮小，原发性卵巢发育不良。45, X男性极为罕见，世界各地至今仅见30余例报道。Hsu认为“纯粹的”45, X男性不可能存在，该类男性的异常核型是由Y染色体上性别决定基因区域易位到常染色体上所致，其实质是一种特殊的Y染色体易位[5]。Y染色体易位至常染色体时会发生遗传物质的丢失，当易位点附近的常染色体遗传物质缺失时，患者通常会有相应的常染色体单体表现[6, 7]，如生长发育迟缓、智力落后、多发畸形等。当易位点附近的Y染色体遗传物质缺失时，患者表现为不同程度的精子缺乏[8, 9]，这是由于Y染色体上的AZF基因缺失所致。AZF基因位于Y常染色质q11区，主要分为3个功能区AZFa、AZFb 及AZFc，其一个或多个区域的缺失会导致精子发生缺陷。最常见的缺失位于AZFc区，它含有一个DAZ （deleted in azoospermia）多基因家族，这个基因的缺失表现最轻微，虽然同样表现为精子缺乏，但睾丸组织还能检出精子，可进行人工辅助生育；而AZFb及以上部位的缺失，精子发生则完全停止，睾丸组织亦不能检出精子存在[3, 10]。

本例患者Y染色体易位未造成13号染色体与Y染色体功能基因的缺失。FISH及Y染色体STS分析显示，患者Y染色体是在长臂q12异染色质区处断裂，近端包括AZF和SRY在内的几乎所有的Y常染色体部分与13号染色体短臂融合，形成一条双着丝粒染色体。易位造成13号染色体随体柄和头的缺失以及Y染色体q12异染色质区和PAR2的缺失，这些区域中都为重复序列，不含功能性常染色质。综合结果提示，本例患者的不育症很可能是由Y染色体易位造成XY性染色体配对异常，形成异常的XY小体，导致生精受阻。一些研究表明[4, 11]在精母细胞减数分裂前期，XY性染色体联会形成一个性小体（sex body），性染色体开始高度凝集并失活，与Y易位的常染色体连带着一起被拖入性泡，失活同时扩展到常染色体部分。正常情况下常染色体与性染色体转录是不同步的，性染色体先失活后转录，而正是由于部分常染色体与性染色体同步失活，导致减数分裂停止，精母细胞凋亡。

Siffroi、Buonadonna等[12, 13]的研究也表明男性不育可能与减数分裂异常相关，其报道的病例AZF未发生任何缺失，却表现了严重的精子缺乏症状。然而Wimmer、Morales等[14, 15]报道了二个家系中携带Y/常染色体易位的男性生育能力似乎未受影响。他们的易位形式完全一样，唯一区别是生育能力不受影响的男性，其易位染色体中的Y着丝粒总是稳定失活的，而有精子缺乏表现的男性易位染色体着丝粒存在不同比例的失活。最新研究表明着丝粒除了装配动粒的功能外，还具有同源染色体配对的功能，在减数分裂早期染色体通过着丝粒间的不同接触，确认同源染色体，然后形成交叉配对[16]。因此对于易位常染色体着丝粒失活的细胞，两条常染色体可能不能联会，形成不联会染色质减数分裂沉默（meiotic silencing f unsynapsed chromatin，MSUC），也就是失活[17]。同时这条易位染色体表现为Y染色体，减数分裂时与染色体形成性小体，导致常染色体失活，细胞凋亡。而对于Y染色体着丝粒失活的细胞，这条易位染色体表现为常染色体，与正常染色体配对不会形成MSUC。并且XY染色体的配对是通过其短臂假常染色体区（PAR）实现的，Y染色体着丝粒失活可能并不影响XY的联会及性小体的形成，因此减数分裂可能不受影响。本例不育患者也发现了易位染色体着丝粒存在不同比例的失活，其中72%的细胞Y染色体着丝粒失活，这类细胞减数分裂可能是不受影响的，其余28%的细胞13号染色体着丝粒失活，可能会引起减数分裂异常。然而外周血比例并不能代表生殖腺的比例，该患者生殖腺13号染色体着丝粒失活的细胞有可能更多，但是我们并没有采集该组织标本，还需进一步验证。这些异常情况都有概率发生少弱精子症的可能。

综上所述，本例患者是Y与13号常染色体易位，形成一条双着丝粒染色体，这类不平衡性易位很少见，但由于未产生任何功能基因组的缺失，因此没有表现相关染色体异常症状。尽管我们未得到睾丸组织病理情况，但是其少弱精子症的发生可能是由于性染色体配对时连带常染色体一起失活而引起生殖细胞减数分裂障碍导致生精受阻，具有明确的病因。其染色体异常不仅可能引起不孕不育，也可能进一步导致怀孕后胎儿流产。患者生殖细胞通过2:1的分离后可能产生以下6种精子：23,X、22,t(Y;13)、23,t(Y;13),X、23,t(Y;13),+13、22,-X、22,X,-13。其中一种是正常的，一种是平衡携带者，其余都是异常的。如果其睾丸组织中可以获得足够的精子行辅助生育，那么子代发生遗传缺陷的风险很高，有可能宫内流产或出生严重畸形的患儿，有必要作植入前诊断或产前染色体检查。而且少弱精程度与染色体异常发生率成正相关，因此我们有必要对这类不孕不育患者都做一下染色体检查，这不管是为了明确其不育原因还是后续治疗处理都有显著临床价值。

参 考 文 献

1 Thielemans BF, Spiessens C, D' Hooghe T, et al. Genetic abnormalities and male infertility. A comprehensive review. Eur J Obstet Gynecoll 1998; 81(2): 217-225

2 Gekas J, Thepot F, Turleau C, et al. Chromosomal factors of infertility in candidate couples for ICSI: an equal risk of constitutional aberrations in women and men. Hum Reprod 2001; 16(1): 82-90

3 Hopps CV, Mielnik A, Goldstein M, et al. Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa, AZFb and AZFc regions. Hum Reprod 2003; 18(8): 1660-1665

4 Delobel B, Djlelati R, Gabriel-Robez O, et al. Y-Autosome translocation and infertility: usefulness of molecular, cytogenetic and meiotic studies. Hum Genet 1998; 102(1): 98-102

5 Hsu LYF. Phenotype/karyotype correlations of Y chromosome aneuploidy with emphasis on structural aberrations in postnatally diagnosed cases. Am J Med Genet 1994; 53(2): 108-140

6 Cui YX, Xia XY, Pan LJ, et al. An infertile male with apparent 45,X turned out to have 45,X,der(Y)t(Y;13)(q1 1.2;q12),-13: clinicopathologic and cytogenomic studies.Fertil Steril 2007; 88(6):1676.e7-e11

7 Chen CP, Lin SP, Tsai FJ, et al. Characterization of a de novo unbalanced Y;autosome translocation in a 45,X mentally retarded male and literature review. Fertil Steril 2008; 90(4): 1198. e11-e18

8 Brisset S, Izard V, Misrahi M, et al. Cytogenetic, molecular and testicular tissue studies in an infertile 45,X male carrying an unbalanced (Y;22) translocation: case report. Hum Reprod 2005; 20(8): 2168-2172

9 Dávalos IP, Rivera H, Vásquez AI, et al. A 45,X sterile male with Yp disguised as 21p. Am J Med Genet 2002; 111(2): 202-204

10 Vogt PH. Genomic heterogeneity and instability of the AZF locus on the human Y chromosome. Mol Cell Endocrinol 2004; 224(1-2): 1-9

11 Sun F, Oliver-Bonet M, Turek PJ, et al. Meiotic studies in an azoospermic human translocation(Y;1) carrier. Mol Hum Reprod 2005; 11(5): 361-364

12 Siffroi JP, Benzacken B, Angelopoulou R, et al. Alternative centromeric inactivationin a pseudodicentric t(Y;13)(q12;p11.2) translocation chromosome associated with extreme oligozoospermia. J Med Genet 2001; 38(11): 802-806

13 Buonadonna AL, Cariola F, Caroppo E, et al. Molecular and cytogenetic characterization of an azoospermic male with a de-novo Y;14 translocation and alternate centromere inactivation. Hum Reprod 2002; 17(3): 564-569

14 Wimmer R, Schempp W, Gopinath PM, et al. A family case of fertile human 45,X,psu dic(15;Y) males. Cytogenet Genome Res 2006; 115(1): 94-98

15 Morales C, Soler A, Bruguera J, et al. Pseudodicentric 22;Y translocation transmitted through four generations of a large family without phenotypic repercussion. Cytogenet Genome Res 2007; 116(4): 319-323

16 Brar GA, Amon A. Emerging roles for centromeres in meiosis I chromosome segregation. Nat Rev Genet 2008; 9(12): 899-910

17 Burgoyne PS, Mahadevaiah SK, Turner JM. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nat Rev Genet 2009; 10(3): 207-216

（2014-09-10收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.01.009

中图分类号R 698.2

*通讯作者, E-mail: taojiong@hotmail.com

Molecular genetic characteristic of male infertility with 45,X

Lu Yonggang, Zhang Jingmin, Sun Wei, Tao Jiong*The International Peace Maternity & Child Health Hospital of China Welfare Institute, Shanghai 200030, China Corresponding author: Tao Jiong, E-mail: taojiong@hotmail.com

AbstractObjective To explore the relationship between spermatogenesis disorder and genetic defects of patients with azoospermia or severe oligospermia，and analyze the possible effcets of chromosome abnormalities on male infertilities. Methodsthods Conventional cytogenetic, fluorescent in-situ hybridization(FISH) and molecular study were performed in the study to detect chromosome abnormalities. Resultssults The conventional cytogenetic analysis showed 45,X,dic(Y;13)(q12;p11) karyotype and the translocation chromosome had only one active centromere. In most of the cell(72%), the Y chromosome centromere was inactivated and the chromosome 13 centromere constricted, with activation. In the remaining cells(36%), the chromosome 13 centromere was inactivated. FISH and molecular studies confirmed the translocation of Y chromosome on the short arm of chromosome 13, and the Y breakpoint is on q12. This dicentric chromosome included the short arm, the centromere and the intact long-arm euchromatin of the Y chromosome and the centromere and the long arm of chromosome 13. There was no any deletion of the functional gene in Y chromosome and chromosome 13. The karyotype was 45,X,dic(Y;13) (q12;p11).ish (SRY+, DYZ3+, GLP13+). Conclusionusion This result suggestss that male infertility might be related to meiotic disturbances with spermatogenetic arrest in Y/Autosome translocations，which could result in infertility by reduction of sperm production.

Key wordsords infertility, male; 45,X male; translocation, genetic