李敏　张丽莉　王国栋等

摘要 优化了杂色鲍原代细胞的培养条件，并利用原代细胞进行了RNAi和外源基因表达。结果表明，较高的渗透压对血淋巴细胞培养起重要作用，淋巴细胞分离液分离血淋巴细胞更利于其生长。原代细胞培养至第5天，在细胞培养液中添加50 μg MyD88 dsRNA，能够显著降低MyD88 mRNA的表达。pEGFPN1转染培养5 d的鳃细胞，5 d后可以检测到绿色荧光。该研究表明可以成功培养杂色鲍血和鳃原代细胞，并且利用原代细胞可以进行功能基因表达量调低或调研究，为功能基因注释提供了便利条件。

关键词 杂色鲍；原代细胞培养；RNAi；转染

中图分类号 S917 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-146-05

Optimizing Primary Cell Culture Method of Haliotis diversicolor and Its Effect for Gene Function Study

LI Min1，2， ZHANG Lili1，2， WANG Guodong1，2* et al

（1. Fisheries College， Jimei University， Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea， Ministry of Agriculture， Xiamen， Fujian 361021； 2. Institute of Aquaculture Biotechnology， Jimei University， Xianmen， Fujian 361021）

Abstract The condition of primary cell culture was optimized in Haliotis diversicolor and these primary cells of hemocyte and gill were used in RNA interference （RNAi） and exogenous gene expression. Results suggested that hemocyte survived better in higher osmolarity of media， the way of using lymphocyte separation medium to culture hemocyte was beneficial for cell growth. MyD88 dsRNA were added to cell culture medium of hemocyte and gill after 5 days of culture which reduced the expression of MyD88. The plasmid pEGFPN1 was transfected into gill after 5 days of culture and the green fluorescence was detected 5 days later. Above all， the primary cell can survived in vitro and they are a proper tool for gene function analysis by regulating gene expression up or down， which provide convenient way for functional annotation.

Key words Haliotis diversicolor； Primary cell culture； RNAi； Transfection

雜色鲍是我国南方地区重要的水产养殖经济物种之一。但是，随着其养殖规模的扩大，爆发性病害日益严重，已成为杂色鲍养殖业重要的限制因素。杂色鲍疾病流行的原因众多[1-3]，但其解决方案却都需要杂色鲍免疫分子机制基础资料的支撑。动物机体是一个完善自稳系统，由多种器官和组织构成，各有专职，但又相互配合影响。以整个动物机体为试验材料进行免疫机制研究时，难以克服各个系统和组织之间的调控和反馈。由于影响因素众多、试验背景复杂，导致试验数据分析困难，难以确切描述处理因素和生物机体响应之间的关系。细胞系因其细胞类型单一、功能一致，可以看作是单个细胞的放大，能够避免上述问题，因此被认为更适合进行免疫功能基因的研究分析[4]。

体外细胞培养已成为研究复杂生命过程的重要手段之一，并在免疫学、病毒学和细胞工程等领域被广泛运用。……