熊志钦　周世水

（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）

摘要 [目的] 构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法] 利用基因敲除技术，敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果] 成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5，用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L，比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论] 利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。

关键词 基因敲除；甲醇；酿酒酵母

中图分类号 S188+.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）15-063-03

Construction of Saccharomyces cerevisiae with Gene Knockout GCV2

XIONG Zhiqin， ZHOU Shishui*

（School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract [Objective] In order to brew low methanol wine， the engineering strain of Saccharomyces cerevisiae was constructed to produce low methanol wine. [Method] The technology of gene knockout was used to knockout GCV2 of glycine cleavage enzyme system in Saccharomyces cerevisiae metabolic pathway of glycine to methanol. [Result] It was succeed to construct the engineering strain L5 of knockout GCV2. The methanol is 131 mg/L in wine brewed by L5. It decreased 31% compared with 192 mg/L methanol in wine brewed by original strain. [Conclusion] It is effective to decrease methanol in wine from glycine metabolized by the Saccharomyces cerevisiae of gene knockout GCV2.

Key words Gene knockout； Methanol； Saccharomyces cerevisiae

甲醇是酒中一种对人体有害的物质，其对人体致死量为143 mg/kg，特别是在人体内有蓄积作用，不易排出[1]。因此，降低酒中甲醇的含量对饮酒人群的健康意义重大。而酒中甲醇来源主要有2个途径：一是由果胶、纤维素等酿酒原料分解产生的甲醇，二是酵母菌自身代谢甘氨酸生成的甲醇[2]，即甘氨酸经甘氨酸裂解酶系催化反应生成甲醇，该酶系复合体中的甘氨酸脱羧酶是由基因GCV2编码生成的P蛋白亚基。基因敲除或基因沉默GCV2能有效地阻断酵母代谢甘氨酸生成甲醇[3]。因此，笔者构建基因敲除酵母GCV2的工程菌，并应用于酿造低甲醇健康酒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒。

酿酒酵母S1由华南理工大学发酵工程实验室保存，质粒pUG6（含抗G418的Kanr筛选标记）购于杭州宝赛生物科技有限公司。

1.1.2 酶、试剂和仪器。

TaqHS酶购于TaKaRa公司，G418、醋酸锂购于纽普诺博生物制品有限公司，小量酵母基因提取试剂盒、质粒制备试剂盒购于艾比根生物技术有限公司。……