齐旺梅 乌 兰 蔡 硕 关宝柱 金 凤 毕力格 白玉华*

(1.内蒙古农业大学，內蒙古 呼和浩特 010018; 2.内蒙古国际蒙医医院，內蒙古 呼和浩特 010065)

腹泻对人和动物引起肠道正常菌群失调，吸收障碍，营养状态和免疫功能降低。小儿反复腹泻易演变为营养不良、佝偻病、贫血、慢惊风等多种慢性疾病［1，2，5］。小儿腹泻蒙医分为寒热两型病。热泻是由于热、锐性外因致小儿三根失调，齐苏和希拉之热偏盛下注肠腑而引起。临床上对小儿腹泻采取辨证分型的基础上进行治疗［3］。

蒙药苏龙嘎-4 汤为止泻作用显著的传统汤剂，由连翘、拳参、木通、麦冬组成。引自《内蒙古蒙成药标准》和《蒙医传统验方》，主治大小肠热、肠刺痛、热泻的传统方剂［4］。临床实验证明苏龙嘎-4 汤以清热，抑希拉，木通清腑之热，拳参解毒和止泻，对大小肠热症有特效［5］。还有对伤寒、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用［6］。

目前临床上常用苏龙嘎-4 汤治疗婴幼儿腹泻病［5，6］，治疗猪肠热痢疾及传染性胃肠炎和藏獒犬细小病毒感染等［7，8］。动物实验证明，苏龙嘎- 4 汤对肠道菌群有影响［9］。腹泻与小肠黏膜上皮细胞的移动及杯状细胞有相关性，苏龙嘎-4 汤的止泻作用可能与小肠黏膜上皮细胞的移动及杯状细胞有关。本文采用番泻叶诱导幼鼠腹泻模型［10］，用细胞标识剂BrdU 标识合成期细胞移动位置，用PAS 染色观察杯状细胞数量观察苏龙嘎-4 汤的干预作用。

1 材料

3 ～4wk 龄wistar 幼鼠25 只，体重64 ±11g(内蒙古大学实验动物繁殖中心购入)，在内蒙古农业大学兽医学院动物实验室内饲养，自由饮水，保持温度20 ±2℃，湿度50～55%，光照早8：00 到晚11：00。苏龙嘎-4、番泻叶购于内蒙古国际蒙医医院。

2 方法

2.1 腹泻模型建立：分为空白组、腹泻模型对照组、苏龙嘎-4 汤低、中和高剂量组，每组各5 只。取0.6g/mL 浓度的番泻叶，连续3d 灌胃2.5mL/Kg。造模d4，灌胃番泻叶煎剂2h 后分别灌胃苏龙嘎-4 汤0.04g/mL(低剂量)，0.06g/mL(中剂量)和0.08g/mL(高剂量)苏龙嘎-4 汤溶液各2.5mL/Kg(体重)，治疗4d;模型组灌胃0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)2.5mL/kg(体重)。

2.2 取材与切片：对所有幼鼠腹腔内注射细胞标识剂BrdU 溶液5mL/kg(体重)，18h 后在麻醉状态下解剖小鼠，取出十二指肠，空肠和回肠的中段部位。用4%多聚甲醛固定24h 以上。

将组织修块为0.5 ～1cm，用5%至20%梯度蔗糖浸泡，液氮中速冻，用冰冻切片机切成4μm。

2.3 免疫组化：将冰冻切片用PBS 缓冲液(含0.05%Tween-20 的pH7.4 的磷酸盐缓冲液)浸泡10min，3 次。为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性染色，在甲醇和0.5%过氧化氢浸泡各30min。蒸馏水洗净后，0.5 盐酸溶液处理15min，PBS 洗净后用50 倍稀释的犊牛正常血清封闭，室温下反应1h，用100 倍稀释的抗BrdU 小鼠IgG(一次血清)，在4℃反应18 ～24h。用PBS 清洗后，加50 倍稀释的小鼠IgG 抗大鼠(二次血清)，反应1h 后用PBS 清洗，用50 倍稀释的小鼠PAP，反应1h，PBS 清洗后，加0.5%DAB 显色液，显微镜下观察细胞核染成棕色或黑褐色(如细胞核以外被染色视为非特异性染色)为终止反应，蒸馏水洗净，苏木精对比染色后进行脱水，透明，封片。

2.4 PAS 染色法：将冰冻切片蒸馏水洗，过碘酸酒精液10min，自来水冲洗，Schiff 氏酒精液避光处理10min，亚硫酸水涮洗15min，流水冲洗。用迈耶苏木精染核1s，流水冲洗，脱水、透明、封固。细胞质内紫红色，细胞核蓝色为PAS 阳性。

2.5 组织学定量法：稀便等级：根据稀便在滤纸上形成污迹面积的直径分为一级(1cm 以下)、二级(1 ～1.9cm)、三级(2 ～3cm)和四级(大于3cm)。

2.6 肠绒毛，肠隐窝和BrdU 阳性上皮细胞的位置：从肠隐窝最底部上皮细胞到肠隐窝开口部上皮细胞的距离为肠隐窝长度;从肠隐窝开口部上皮细胞到肠绒毛最顶部上皮细胞的距离为肠绒毛长度。从肠隐窝最底部上皮细胞到肠绒毛BrdU 阳性上皮细胞的最领先细胞的距离为BrdU 阳性上皮细胞的移动位置。各组5 个幼鼠的小肠各部位组织中任选20 个肠隐窝和肠绒毛测量。

2.7 杯状细胞数量：由于个体差异肠绒毛长短不同，肠绒毛上皮细胞的数量也有所不同。为了比较各部位同一个位置中存在的杯状细胞数量，本实验统计了从肠绒毛根部往上200um 距离之内存在的杯状细胞数量。

3 结果

3.1 对腹泻模型幼鼠：用番泻叶灌胃建立腹泻模型幼鼠效果显著。番泻叶灌胃1h 后出现稀便，3 ～5h 稀便程度最高，6h 候后稀便数量逐渐减少(图1)。

3.2 小肠黏膜组织学定量结果：在光学显微镜下观察发现，幼鼠小肠黏膜没有明显的皱褶，有指状肠绒毛和管状的肠隐窝。幼鼠小肠肠绒毛从十二指肠到回肠逐渐变短。肠隐窝各部位间没有显著差异。但在十二指肠和空肠，腹泻组的肠绒毛比空白组短，治疗组的肠绒毛比腹泻组长(图2，3);肠隐窝在腹泻组比空白组变长，在治疗组比腹泻组长(图4，5)。在回肠、肠绒毛和肠隐窝长度在腹泻组和治疗组与空白组没有显著差异(图6，7)。

图3

图5

图7

3.3 BrdU 阳性肠绒毛上皮细胞的移动：BrdU 腹腔注射后在肠隐窝增殖细胞的合成期细胞核内进入细胞标识剂BrdU。用单克隆抗体检出BrdU 阳性上皮细胞，测量其最领先细胞的位置为该上皮细胞的18h 候内肠绒毛上移动的距离。与空白组比较，腹泻和治疗组BrdU 阳性上皮细胞的位置在十二指肠和空肠逐渐增加，尤其在高剂量组显著增加(图8，9)。在回肠没有显著差异(图10)。

图8

图9

图10

3.4 杯状细胞的数量：与空白组比较杯状细胞的数量在腹泻组减少，在治疗组比腹泻组增加，整体看在高剂量组增加的数量比低中剂量明显多(图11，12，13)。

图11

图12

图13

4 讨论

番泻叶诱导幼鼠腹泻是常用方法，番泻叶为刺激性泻药，通过肠黏膜和神经从刺激肠蠕动，番泻甙在小肠部分被吸收，后经血流或胆汁进入大肠，而主要则由小肠直接进入大肠，在肠内细菌作用下经水解、还原等变化成为大黄酸蒽酮或大黄酸蒽酮-8 -葡萄糖甙。番泻甙可阻止葡萄糖和Na 的跨肠壁转运吸收。本次研究表明，幼鼠腹泻后十二指肠和空肠肠绒毛明显变短，表明番泻叶在小肠的近段影响较大，加快肠黏膜上皮细胞脱落，导致肠绒毛变短。但在回肠影响不明显是也许在小肠近段被消化吸收的较快，对回肠的刺激较小。肠隐窝在腹泻组有所增加是为了补充脱落的上皮细胞，机体调节肠隐窝上皮细胞的增殖和分化。苏龙嘎-4 汤治疗后肠绒毛和肠隐窝均变大的结果表明，苏龙嘎-4 汤对腹泻幼鼠的肠上皮细胞生长发育具有调节和促进作用。

杯状细胞数量结果表明，腹泻引起肠黏膜屏障被破坏，内环境失调，黏液细胞分泌被抑制，数量减少。但苏龙嘎-4 汤治疗后，杯状细胞明显增加，揭示了苏龙嘎-4 汤对杯状细胞的分化和生长具有一定的调节和促进作用。苏龙嘎-4 汤促进分泌黏液的杯状细胞的分泌功能，改善肠道内环境，修复黏膜屏障的完整性，从而起到止泻作用。

苏龙嘎-4 汤中、高剂量组作用效果显著，具有明显的量效关系，如临床效果弱时可根据实际情况提高给药剂量，以保证疗效。

［1］张琳，腹泻患儿肠道菌群微生态学研究进展［J］.河北医药，1994，16(6)：354 -355.

［2］格林其木格.蒙医儿科学［M］.赤峰：内蒙古科学技术出版社，1988：222.

［3］吉格木德.蒙医基础理论［M］.呼和浩特：内蒙古人民出版社，1984.

［4］内蒙古自治区卫生厅编.内蒙古蒙成药标准［M］.赤峰：内蒙古科学技术出版社，1984：12.

［5］红梅.蒙医治疗70 例婴幼儿腹泻临床观察［J］.中国民族医药杂志，2000，(3)：18.

［6］钢巴特尔，图雅.苏龙嘎-4 汤、扫日劳-4 汤、永瓦-4汤抑菌作用的对比研究［J］.中国民族医药杂志，2005，(1)：21 -22.

［7］谢宝昌，等.苏龙嘎-4 汤治疗猪肠热痢疾［J］.中兽医杂志，1992，69(4)，10.

［8］李光辉，等.蒙药苏龙嘎-4 汤加减治疗藏獒犬细小病毒感染初探［J］.内蒙古民族大学学报(自然科学版)，2008，23(8)，176 -178.

［9］齐旺梅，等.苏龙嘎-4 汤对腹泻幼鼠肠道乳酸杆菌、大肠杆菌和总需厌氧菌的影响［J］.中国民族医药杂志，2014，4(20)，47 -49.

［10］郎秀壮，丁旺.番泻叶的研究概况［J］.实用医技杂志，2005 12(5)，1294.