张 旭陈 岩赵世光任 颖

1）哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科 哈尔滨 150001 2）黑龙江省第二医院ICU病房 哈尔滨 150001

·论著·

三氧化二砷脂质体治疗大鼠C6脑胶质瘤的实验研究

张 旭1）陈 岩1）赵世光1）任 颖2）

1）哈尔滨医科大学附属第一医院神经外科 哈尔滨 150001 2）黑龙江省第二医院ICU病房 哈尔滨 150001

目的 研究三氧化二砷（As2O3）脂质体对荷瘤大鼠血脑屏障（BBB）的透过率及其对大鼠脑胶质瘤的生长抑制作用。方法 应用超声薄膜分散法制备As2O3脂质体，检测其包封率；建立大鼠脑胶质瘤模型，分别给予As2O3脂质体和As2O3，应用原子荧光法检测给药后大鼠脑组织中的砷浓度，以判定其对血脑屏障的透过性，并与给予生理盐水的对照组相比，从电镜、TUNNEL、MRI影像及大鼠的生存状态等方面研究As2O3脂质体对C6胶质瘤的影响。结果 As2O3脂质体组砷的血脑屏障透过性明显提高，电镜及TUNEL法检测示肿瘤细胞凋亡率（20.03%）高于其他2组（3.92%、4.09%）；大鼠中位生存时间（70d）优于生理盐水组（21d）和As2O3组（23d）。结论 As2O3脂质体可以明显提高鼠脑内As2O3浓度，并能诱导胶质瘤细胞的凋亡，抑制大鼠脑胶质瘤的生长，从而延长荷瘤大鼠的生存时间。

三氧化二砷；脂质体；神经胶质瘤；细胞凋亡

体外研究［1］结果表明，As2O3也可抑制脑胶质瘤细胞的增殖，但因对BBB的低透过率，难以发挥有效的作用。此外，砷剂在体内代谢快、有效作用时间短等问题也未能完全解决。所以，确定As2O3治疗脑胶质瘤的最佳给药途径及确保肿瘤部位的有效浓度是目前研究的重点。脂质体类药物可解决很多药物不能透过BBB的问题，且脂质体类药物的局部靶向作用也可提高药物的疗效［2］。本实验制备As2O3脂质体，对C6脑胶质瘤模型大鼠进行尾静脉注射，观察对大鼠脑胶质瘤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 日本关西医科大学提供的大鼠C6脑胶质瘤细胞株；北京东方丁香园国际医学研究院提供的Wistar雄性大鼠，体质量230～250g；As2O3注射液（哈尔滨医科大学，伊达制药厂）；注射级大豆卵磷脂（上海太伟药业）；胆固醇、维生素E粉、葡聚糖聚50水凝胶（Sigma公司）等。

1.2 主要仪器 RE－52AAB旋转蒸发器；JY92－2D型超声波细胞粉碎机（浙江）；UV－2550分光光度计（日本岛津）；1.5 TVISRT型磁共振机（日本东芝）；透射电子显微镜（JENM1220）；倒置相差显微镜（OLYMPUS）；AFS－930原子荧光光谱仪（吉天仪器公司）。

1.3 制备As2O3脂质体 精密称取卵磷脂：胆固醇：维生素E（20︰5︰1）于茄形瓶，向内加入适量氯仿溶解，均匀混合，40℃减压旋转蒸发；精密称取适量As2O3，溶于去离子水，加热溶解，制备成含As2O31mg／mL的溶液，该溶液加入上述具有磷脂和胆固醇脂质膜的茄形瓶中，旋转水化15min，冰浴超声，即得稳定的乳白色As2O3脂质体溶液，通过选择的超声时间及强度可获得粒径为0.25～1μm的单层脂质体。根据《中华人民共和国药典》，银盐法检测As2O3脂质体的包封率［3］。

1.4 检测大鼠脑组织中的砷含量 大鼠84只，随机分为2组（As2O3脂质体组、As2O3组），每组42只，分别经尾静脉注射As2O3脂质体和As2O3注射液，剂量为2mg／（kg·d）；分别在给药后0.5、1、2、4、8、16、24h各取6只大鼠脑组织，液氮冻存，研磨，原子荧光法检测组织中的砷含量。

1.5 载瘤动物模型的建立 制备C6胶质瘤细胞悬液（1× 106／10μL），应用大鼠头部立体定向仪在大鼠右侧尾状核种植10μL细胞悬液［4－5］。7d后进行MRI检查，观察鼠脑成瘤情况。选取肿瘤生长情况较一致的大鼠共54只，随机分组，分别给予尾静脉注射As2O3水溶液、As2O3脂质体、生理盐水，给药1次／d，共7d；用药后第3、7天每组分别随机处死6只大鼠，剥离脑胶质瘤，对其进行电镜观察和凋亡检测。

1.6 观察指标 （1）大鼠的存活情况：每组6只大鼠，观察其生存状态及生存期。（2）MRI检查观察肿瘤体积：于停药后第2天和第7天做2次MRI检查。肿瘤体积计算公式：体积（V）＝长·宽·高·π／6。（3）电镜观察：以2%戊二醛固定鼠脑胶质瘤组织，透射电镜观察亚细胞结构。（4）凋亡检测TUNEL法检测凋亡情况：操作按照原位细胞凋亡检测试剂盒进行，细胞核内的棕褐色染色为阳性细胞，每张切片随机选择5个视野，两人双盲高倍镜下计数500个细胞中的阳性细胞数，取均值。

2 结果

2.1 包封率 银盐法检测As2O3脂质体的包封率为90%。

2.2 砷含量检测 采用原子荧光法测定大鼠脑组织中的砷浓度，结果发现，给药后各时间点As2O3脂质体组均高于As2O3组，经析因方差分析，差异有统计学意义（P＜0.001）。见图1。

图1 大鼠脑组织中砷含量

2.3 大鼠存活情况观察 接种肿瘤第3天开始，大鼠饮水、进食及运动减少，攻击性下降，精神萎靡，毛色失去光泽，逐渐消瘦。第14天时，生理盐水组和As2O3组部分大鼠逐渐出现对侧或双侧肢体无力、活动不灵活，亦有部分大鼠出现突发抽搐、易激惹等表现；濒死前该2组大鼠均表现刺激反应减弱，甚至木僵状态、呼吸细弱或不规则，不进饮食、极度消瘦、恶液质等症状。生理盐水组和As2O3组的中位生存时间分别为为21和23d；As2O3脂质体组的大鼠在给药后7d情况逐渐好转，一般情况基本正常，直至58d时仅1只死亡，剩余5只在给药后第70天处死，其中3只大鼠的大脑切片未见肿瘤，2只大鼠脑内仍有肿瘤存在。由此可见，As2O3脂质体组的生存期与生理盐水组和As2O3组相比明显延长（P＜0.01），且未见有砷中毒现象。

2.4 MRI检查结果 给药第7天，生理盐水组和As2O3组肿瘤体积增大，As2O3脂质体组肿瘤体积未见增大；停药后第7天，As2O3脂质体组肿瘤体积较其他2组比较，明显缩小（图2），生理盐水组和As2O3组肿瘤体积增大。见表1。

图2 MRI影像

2.5 凋亡检测 给药第3天、7天，生理盐水组、As2O3组、As2O3脂质体组阳性染色率依次分别为（3.15±0.34）%和（3.92±0.57）%，（3.18±0.41）%和（4.09±0.54）%，（13.53±1.68）%和（20.03±0.79）%。析因方差分析结果显示，As2O3脂质体组的阳性染色率明显高于As2O3组和盐水组，差异有统计学意义（P＜0.01）。且As2O3脂质体组给药7d大于给药3d的肿瘤组织阳性细胞数（P＜0.01）。见图3。

2.6 电镜观察结果 As2O3脂质体组肿瘤细胞粗面内质网脱颗粒，线粒体嵴断裂，髓样变甚至空泡样变性，细胞核固缩，核膜下有高密度的染色质斑块边集等凋亡改变，凋亡细胞多于As2O3组和生理盐水组。As2O3组和生理盐水组中，周边部肿瘤异型性明显，生长活跃，肿瘤中心的凋亡细胞多于周边部。见图4。

表1 各组移植瘤体积测定结果比较 （±s，mm3）

表1 各组移植瘤体积测定结果比较 （±s，mm3）

注：与As2O3脂质体组比较，＊P＜0.01

组别移植瘤2周移植瘤3周生理盐水组101.59±20.78＊149.03±25.32＊As2O3组102.37±21.01＊147.34±28.76＊As2O3脂质体组61.55±16.79 25.74±11.37

图3 TUNEL法凋亡检测（可见细胞核内的棕褐色染色为阳性细胞TUNEL×400倍）

图4 As2O3脂质体组肿瘤组织的凋亡细胞结构

3 讨论

神经胶质瘤是中枢系统最常见的恶性肿瘤，在我国统计占颅内肿瘤的33.3%～58.9%，目前，胶质瘤主要采取以手术为主的综合治疗措施，但复发仍无法避免［6］，因此，探索更为有效的脑胶质瘤治疗方法已成为迫切的临床要求。

As2O3可抑制U87MG和T98G胶质瘤细胞增殖［7］，但BBB对As2O3的低透过率，成为临床应用研究的障碍。BBB的内皮细胞紧密联接排列，只允许亲脂性、低分子量的药物被动转运［8］。脂质体模拟细胞膜结构，由磷脂双层构成，具有水相内核，作为抗癌药物的载体具有很以下褚多优点：增加在血液中的保留时间，靶向作用于癌细胞，不良反应低，疗效高。脂质体脑内给药，可以产生脑靶向性，延缓药物的消除，延长作用时间，有利于向病变组织分布，可持续释放药物，显著增加药物在脑组织内的转运量［9］。故本实验为选用脂质体为载药系统，期望为砷剂的在体应用寻求一个新途径。

本实验将As2O3制成单层脂质体，可以避免巨噬细胞对As2O3的吞噬、清除，可以增加As2O3的载药量及对血脑屏障的透过率，原子荧光法检测的大鼠脑组织中砷含量明显高于单纯的As2O3注射组，所以As2O3脂质体提高了As2O3对血脑屏障的透过率。

体外实验结果证实As2O3可诱导胶质瘤细胞凋亡［7］，本研究中大鼠脑胶质瘤组织电镜及切片可观察到，As2O3脂质体组胶质瘤细胞结构出现了细胞凋亡，但生理盐水组和As2O3组除了肿瘤中心坏死区，其他部位凋亡的胶质瘤细胞少见。因此，我们认为As2O3不能高效透过血脑屏障，无法对对胶质瘤发挥有效的治疗作用。原位凋亡检测也证实了As2O3脂质体组能明显诱导胶质瘤细胞凋亡，而As2O3组和生理盐水组诱导胶质瘤细胞凋亡作用不明显。另外，As2O3脂质体组第7天的凋亡率高于第3天，以上结果均证实脂质体可以载As2O3高效透过血脑屏障，提高了其对胶质瘤的治疗效果。

实验中MRI影像显示，As2O3脂质体组大鼠的肿瘤体积明显小于As2O3组和生理盐水组，As2O3组和生理盐水组胶质瘤体积随时间的延长而增大，2组间差异无统计学意义。大鼠的生存期观察也表明As2O3脂质体较单用As2O3和生理盐水可明显抑制大鼠脑部移植胶质瘤的生长，我们认为其抑制作用与有效剂量的As2O3进入血脑屏障从而诱导肿瘤细胞凋亡有关。

综上所述，As2O3脂质体可以通过诱导C6胶质瘤细胞凋亡，抑制大鼠脑胶质瘤组织的生长。As2O3的毒性作用，尤其是其对正常脑组织的损害，随着As2O3进入脑组织的量增大而增加，本实验所给的药物剂量是属安全范围之内的As2O3剂量［10］，我们在预实验中也未发现此剂量对大鼠肝、肾等主要脏器有明显的损害。因此，As2O3脂质体可能为As2O3治疗脑胶质瘤提供一种可行的、有效的途径。但探索As2O3的药物代谢动力学以及其在局部脑组织中的适宜治疗浓度等问题仍有待进一步研究。

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（收稿2015－03－25）

Experimental study of As2O3liposomes for the treatment of C6glioma in rats

Zhang Xu＊，Chen Yan，Zhao Shiguang，Ren Ying
＊Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin150001，China

Objective To investigate the permeation rate of As2O3liposomes passing blood brain barrier（BBB）in tumorbearing rats and its inhibition effect on the C6glioma growth in vivo.Methods The As2O3liposomes were developed by film－ultrasonic wave dispersion method and the encapsulation efficiency was performed.Then all rats were intravenously injected by As2O3liposomes and As2O3respectively after successfully establishing the glioma models in rats.After that，As2O3concentration of brain tissue was measured using atomic fluorescence technique to assess permeability of blood brain barrier.Compared with controls injected by normal saline，we studied the effect of As2O3liposomes on C6glioma from the following aspects including electron microscopy，TUNNEL staining，Magnetic Resonance Imaging（MRI）and the survival condition.Results The As2O3liposomes could obviously facilitate permeability of blood brain barrier.The results of electronic microscopic analysis and TUNNEL staining showed that the apoptosis rate（20.03%）of tumor cells in As2O3liposomes group was much higher than that in the other two groups（3.92%，4.09%）.As2O3liposomes group had longer median survival time of 70days than 21 days in the saline group and 23days in As2O3group.Conclusion The As2O3liposomes can significantly improve the As2O3concentration of rats＇brain，and can induce apoptosis in glioma cells and suppress intracranial tumor growth and prolong the life span of tumor－bearing rats.

As2O3；Liposome；Glioma；Apoptosis

R－332

A

1673－5110（2015）24－0001－03

黑龙江省自然科学基金项目资助（编号：D201155）