李雪飞，江洪，胡笑容，马瑞松

论著·基础

橙皮苷对大鼠心肌缺血/再灌注损伤诱导自噬的影响机制研究

李雪飞，江洪，胡笑容，马瑞松

目的 探讨橙皮苷对大鼠心肌缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞自噬的影响及其可能机制。方法 24只雄性SD大鼠随机均分为假手术组、缺血/再灌注(I/R)组及橙皮苷组，每组8只。假手术组予0.5%羧基纤维素钠灌胃3 d后，开胸暴露冠状动脉左前降支(LAD)，并不结扎，I/R组及橙皮苷组予以阻断LAD血流30 min后再灌注4 h，建立大鼠心肌缺血/再灌注损伤模型。术后，检测大鼠血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)，心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)和Beclin1的水平。结果 与假手术组相比，I/R组大鼠血清中CK及LDH水平均显著升高，心肌组织SOD活性显著降低，MDA含量显著升高(P均<0.05)；与I/R组比较，橙皮苷组大鼠血清中CK及LDH水平明显降低，心肌组织SOD活性显著升高，MDA含量明显降低(P均<0.05)。与假手术组比较，I/R组大鼠心肌组织LC3Ⅱ及Beclin1表达水平显著增高，与I/R组比较，橙皮苷组上述2项指标表达水平明显降低(P<0.05)。结论 橙皮苷可抑制心肌缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞自噬，其机制与橙皮苷减轻氧化应激相关。

橙皮苷；心肌缺血再灌注损伤；自噬；氧化应激；大鼠

对于急性心肌梗死患者，再灌注治疗是拯救缺血心肌及改善临床预后的最佳手段。而再灌注本身可使尚存活的心肌细胞死亡，进而加重心肌损伤[1]。自噬作为维持细胞稳态的一种自我保护机制，在生理情况下可降解及再利用老化的长寿蛋白质及膜包被的细胞器[2]。然而过度的自噬可溶解正常的蛋白质及细胞器，导致细胞死亡[3]。研究表明，自噬在心肌缺血/再灌注损伤中有着重要的作用[4]。在心肌缺血期间，自噬可降解无重要功能的蛋白质为细胞的生命活动提供能量，起到保护心肌的作用；而在再灌注期间，自噬可被过度激活从而导致细胞损伤及死亡，进而加重心肌缺血/再灌注损伤[5]。

橙皮苷属于黄烷酮类化合物，在橘柑类的水果中含量丰富，具有抗氧化、抗炎、抗电离辐射等多重生物活性[6～8]。有研究报道，橙皮苷可减轻心肌缺血/再灌注损伤，表现为抑制心肌细胞凋亡及减轻氧化应激，但其对自噬的影响目前尚未见报道[9，10]。故本实验旨在探讨橙皮苷在心肌缺血/再灌注期间对自噬的作用及相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验动物：SPF级雄性SD大鼠24只，体质量200～250 g，购于武汉大学动物实验中心，饲养环境维持25℃、黑暗与照明各交替12 h。术前12 h禁食、不禁饮。(2)主要试剂：橙皮苷(HPLC>90.0 %)及羧基纤维素钠(购于国药集团化学试剂有限公司)，戊巴比妥钠(购于美国Sigma公司)。主要仪器：Biopac多导生理记录仪、计算机图像分析系统(Image-Pro Plus3.0，Media Cyerneties公司)，荧光显微镜(BX53，中国奥林巴斯有限公司)。

1.2 动物模型建立及分组 (1)建立模型： 0.5%羧基纤维素钠或橙皮苷混悬液灌胃3 d后，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将其固定于解剖台，气管插管，连接动物呼吸机通气(70次/min)，连续监测肢体II导联的心电图。左胸廓切开术暴露心脏，剪开心包膜，在肺动脉圆锥与左心耳下缘之间找到左前降支(LAD)，将5-0丝线用手术弯针穿至LAD下，结扎处放置微小塑料管。阻断LAD 30 min后，剪断结扎线，取出塑料管，再灌注4 h。造模成功标准：缺血时肢体II导联ST段抬高及心脏表面变苍白或紫绀，再灌注后ST段回落1/2以上，心脏表面苍白或紫绀区变红。(2)实验分组：24只大鼠随机均分为假手术组、缺血/再灌注(I/R)组及橙皮苷组，每组8只。假手术组：0.5%羧基纤维素钠灌胃3 d后，只穿线，不结扎[11]；I/R组：0.5%羧基纤维素钠灌胃3 d后，阻断LDA 30 min，再灌注4 h；橙皮苷组：0.5%羧基纤维素钠与橙皮苷(200 mg/kg)混悬液灌胃3 d后，阻断LAD 30 min，再灌注4 h[12]。

1.3 观测指标 术后大鼠均取颈静脉血离心，取上清液备用；取出心脏，剪取左心室缺血区心肌组织存于-80℃冰箱备用。

1.3.1 血清心肌酶的测定： 大鼠再灌注后，经颈静脉采血2 ml，3 000 r/min离心15 min，收集上清液，采用全自动生化分析仪测定血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)含量(试剂盒购于南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 心肌组织氧化应激指标的测定: 冰冻缺血区心肌组织匀浆，4 000 r/min离心，取上清液。根据试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书步骤检测超氧化物歧化酶(SOD)的活力及丙二醛(MDA)的含量。

1.3.3 心肌组织自噬蛋白检测: 冰冻缺血区心肌组织匀浆，取适量组织裂解液提取心肌组织总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度。取50 μg总蛋白上样，经10% SDS-PAGE分离，4℃下恒压转膜，室温下用含5%脱脂奶粉TBST封膜2 h，加入抗微管相关蛋白1轻链3(LC3)抗体(稀释1∶1 000)或抗Beclin1(稀释1∶1 000)(皆购于美国Cell Signaling Technology 公司)，4℃孵育过夜；TBST充分洗膜，加入辣根过氧化酶标记二抗，室温孵育2 h；漂洗后滴加适量化学发光(ECL)底物液，孵育数分钟后常规显影。使用计算机图像分析系统分析条带灰度值，磷酸甘油醛胱氢酶(GAPDH)标准化待测蛋白的表达。

1.3.4 免疫荧光法观察心肌组织LC3 II表达: 10%甲醛固定心肌，石蜡包埋后切片。石蜡切片经脱蜡、抗原修复、血清封闭后，滴加鼠抗兔抗LC3 II抗体(稀释1∶100)(购自美国Cell Signaling Technology 公司)，4℃孵育过夜；PBS冲洗玻片后，滴加荧光标记的羊抗兔IgG(购自武汉博士德生物工程有限公司)，湿盒中37℃孵育1 h。在暗室中滴加细胞核染色剂4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，购自中国碧云天生物公司)孵育5 min，PBS冲洗后擦干封片，在荧光显微镜下观察采集图像。其中细胞核呈蓝色，LC3 II呈绿色。

2 结 果

2.1 血清心肌酶水平 与假手术组相比，I/R组大鼠血清中CK及LDH水平均显著升高(t=-4.273、-7.894，P均<0.05)，提示再灌注后心肌损伤加重；而橙皮苷组大鼠血清中CK及LDH的水平明显低于I/R组(t=4.179、6.430，P均<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠血清心肌酶CK及LDH的变化

注：与假手术组比较，aP<0.05；与I/R 组比较，bP<0.05

2.2 心肌组织SOD及MDA水平 与假手术组相比，I/R组大鼠心肌组织SOD的活性显著降低,而MDA含量显著升高(t=10.097、-6.863,P均<0.05)，表明心肌缺血/再灌注后心肌组织氧化应激反应增高。与I/R组比较，橙皮苷组SOD活性显著升高且MDA含量降低(t=-11.062、7.974，P均<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠心肌组织SOD及MDA的变化

注：与假手术组比较，aP<0.05；与I/R 组比较，bP<0.05

2.3 心肌组织LC3II及Beclin1 与假手术组大鼠心肌组织Beclin1(0.108±0.026)及LC3II(0.136±0.013)的表达水平比较，I/R组大鼠心肌组织Beclin1(0.518±0.050)及LC3II(0.517±0.062)的表达水平显著增高(t=-18.919、-14.560，P均<0.05)，提示再灌注后缺血心肌自噬增强。与I/R组比较，橙皮苷组大鼠心肌组织Beclin1(0.198±0.019)及LC3II(0.234±0.034)的表达水平明显低于I/R组(t=17.489、10.815，P均<0.05)。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织Beclin1及LC3II的表达变化

2.4 心肌组织LC3II表达 假手术组大鼠心肌组织LC3II的表达极少，几乎不可见；I/R组大鼠心肌组织可见大量的LC3II表达，提示缺血/再灌注后心肌自噬被显著激活。而橙皮苷组大鼠心肌组织LC3II的表达明显低于I/R组。图2见封3。

3 讨 论

正常情况下，自噬在心肌细胞中处于低水平状态，起着维持细胞稳态的作用。而在心肌缺血/再灌注损伤中，随着缺血、低氧时间的延长，自噬在心肌缺血期被激活，此时自噬可降解心肌细胞中无重要功能物质，给缺血缺氧心肌提供营养物质，对心肌细胞起着保护作用；而再灌注期间，自噬进一步增强，过度的自噬可降解心肌细胞中关键成分，引发心肌细胞结构及功能障碍，促进心肌细胞死亡[5]。故自噬在心肌缺血/再灌注损伤中有着重要的作用。Beclin1是自噬体形成过程中不可或缺成分，而LC3则直接参与自噬体的形成[13]，Beclin1和LC3的表达越多则表明自噬越强。在本实验中，与假手术组相比，I/R组大鼠心肌组织自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达显著增加，且这种变化在心肌组织LC3B荧光染色中得到进一步证实，提示再灌注后心肌组织的自噬显著增强。同时，I/R组大鼠血清心肌酶CK及LDH的水平也显著高于假手术组，提示缺血再灌注后过度自噬可加重心肌细胞损伤，表明自噬在再灌注期间起着心肌损伤作用。

橙皮苷是一种在橘柑类水果中含量丰富的黄烷酮类化合物，近年来因其多样的生物活性引起了许多研究者的关注。Huang等[14]报道了在β样淀粉蛋白诱导的神经细胞糖代谢损伤模型中，橙皮苷可下调自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达，抑制自噬的激活，改善神经细胞糖代谢损伤，促进神经细胞的存活。而Saiprasad等[15]研究表明橙皮苷可上调自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表达，触发结肠肿瘤细胞自噬，抑制氧化偶氮甲烷诱导的结肠恶性肿瘤的发生。在本实验模型中，与I/R组相比，橙皮苷组大鼠心肌组织LC3Ⅱ和Beclin1的表达显著下降，且血清CK和LDH的水平也显著降低，表明橙皮苷可能通过抑制心肌细胞自噬，进而减轻心肌缺血/再灌注损伤。

心肌缺血/再灌注期间诱发自噬的因素很多，包括低氧、缺血、ATP耗竭、内质网应激及氧化应激等[16]。Hariharan等[17]报道了在心肌细胞缺氧/复氧模型中，过氧化氢所致氧化应激损伤可显著升高自噬蛋白LC3的表达，而巯丙酰甘氨酸(一种抗氧化剂)可显著减轻氧化应激的同时降低LC3的表达，表明氧化应激可激活自噬，且减轻氧化应激可抑制自噬。SOD作为胞内抗氧化系统的主要抗氧化酶之一可体现细胞抗氧化的能力，其活性越高则细胞抗氧化能力越高；而MDA作为脂质过氧化反应的主要代谢产物反映了脂质过氧化反应的严重程度，其含量越多则脂质过氧化反应越重；两者皆可作为氧化应激的指标。在本实验中，与假手术组相比，I/R组大鼠心肌组织的抗氧化酶SOD活性显著降低且脂质过氧化指标MDA显著升高，提示再灌注后心肌组织氧化应激严重；且同时伴随着自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的增加，提示心肌缺血/再灌注后，氧化应激诱发自噬的过度激活，与上述文献结果一致。Gandhi等[9]报道了橙皮苷在心肌缺血/再灌注模型中可显著减轻氧化应激，提示橙皮苷具有较强的抗氧化活性。在本实验中，橙皮苷组大鼠心肌组织SOD的活性显著增高，MDA的含量明显降低，同时LC3Ⅱ和Beclin1的表达也显著降低，提示橙皮苷可能通过抑制氧化应激，进而抑制过度自噬的发生，从而减轻心肌缺血/再灌注损伤。

综上所述，橙皮苷可抑制心肌缺血/再灌注损伤诱导的心肌细胞自噬，进而减轻心肌缺血/再灌注损伤，其机制与橙皮苷减轻氧化应激有关[17～19]。但本研究只观察了橙皮苷对再灌注时期自噬的影响，而橙皮苷对单纯缺血期自噬的作用尚未关注。另外，橙皮苷抑制心肌缺血/再灌注损伤所诱导自噬的具体分子机制也仍待进一步研究。

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The effects of hesperidin on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by autophagy

LIXuefei,JIANGHong,HUXiaorong,MARuisong.DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:JIANGHong,E-mail:jianghwurm@163.com

Objective To investigate the effect of hesperidin on myocardial ischemia/reperfusion injury of myocardial cells induced by autophagy and its possible mechanism.Methods 24 male SD rats were randomly divided into sham operation group, ischemia / reperfusion (I/R) group and hesperidin group with 8 rats in each group. Sham operation group were treated with 0.5% carboxymethylcellulose sodium orally, after 3 days, thoracotomy were performed to expose the left anterior descending coronary artery (LAD) but not ligation, in I/R group and hesperidin group were blocking LAD’s flow for 30 min, then with 4 hours of reperfusion to establish the rat myocardial ischemia / reperfusion injury model. After the operation, detected the serum creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) and autophagy protein, microtubule associated protein 1 light chain 3 II (LC3 II) and Beclin1 level in the myocardial tissue. Results Compared to sham operation group, I/R group rats’ serum CK and LDH levels were significantly increased, SOD activity of myocardial tissue were significantly decreased, MDA content significantly increased (P<0.05), compared with I/R group, hesperidin group’s serum CK and LDH levels significantly decreased, SOD activity of myocardial tissue was significantly increased, MDA content decreased significantly (P<0.05). Compared with the sham group, I/R group rats’ myocardial tissue LC3 II and Beclin1 levels increased significantly, compared with I/R group, hesperidin group’s index expression levels were significantly lower (P<0.05).Conclusion Hesperidin can inhibit myocardial ischemia / reperfusion injury induced cardiomyocyte autophagy, and the mechanism is related with hesperidin reduce the oxidative stress.

Hesperidin; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Autophagy; Oxidative stress; Rats

430060 武汉大学人民医院心血管内科

江洪，E-mail:jianghwurm@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.024

2015-05-30)