陈寅生侯春林*魏长征韩帅

羟 丁 基 壳 聚 糖 的 生 物 相 容 性 研 究*

陈寅生1侯春林1*魏长征2韩帅1

目的研究新型温敏性生物材料羟丁基壳聚糖的生物安全性，初步探讨该材料植入体内有无毒副作用。方法将壳聚糖进行羟丁基化制备出温敏性水凝胶，选用小鼠成纤维细胞L929细胞，通过MTS法、倒置显微镜观察等方法进行体外细胞毒性试验。通过SD大鼠尾缘静脉浸提液注射，进行急性毒性试验，通过新西兰兔耳缘静脉浸提液注射及皮内浸提液注射，进行致热原反应试验及皮内刺激试验。结果 羟丁基壳聚糖无细胞毒性，不引起试验动物体温升高，无皮肤刺激反应，急性毒性试验不引起试验动物死亡或者其它不适。结论 羟丁基壳聚糖材料生物相容性好，是一种安全的生物材料，有望作为新型药物载体应用于临床。

羟丁基壳聚糖；温敏性；生物相容性

1 引言

近几十年以来，在生物医用研究中，由于高含水量、高膨胀性等特性，水凝胶引起了人们的高度重视。其中原位凝胶更是受到许多研究的青睐，它可以提供一种简单的治疗和诊断手段。高分子溶液通过聚合、化学交联、离子交联或受到外部环境的变化如温度、pH、离子强度等，在与原位形成凝胶。其中温敏性凝胶作为一种智能凝胶成为生物材料的研究热点。温敏性凝胶主要有一下几个特性和有优点，如操作方便具有可注射性;凝胶化过程中不需要加入其的化学交联剂和其他复杂操作进而提高了材料的生物安全性和相容性。

本课题组在国内率先研制了基于壳聚糖的温敏性材料，即通过对壳聚糖进行羟丁基化改性，制备具有温敏特性的羟丁基壳聚糖 (Hydroxybutyl chitosan,HBC)，大量的前期研究表明羟丁基壳聚糖凝胶具有良好的温度响应性，即低温下为流动的液体，而在生理温度下转变为不流动的凝胶，且该过程为可逆过程。同时我们在国际上首次探讨了其生物医用研究，结果显示其具有良好的预防术后组织粘连、脑脊液封堵以及止血等生物学功能。

在前期研究的基础上，本文主要探讨羟丁基壳聚糖的生物相容性，主要从细胞毒性、生物相容性等方面探讨了羟丁基壳聚糖的生物安全性，即选用小鼠成纤维细胞L929细胞，通过细胞增殖度检测、倒置显微镜观察等方法，为进一步应用提供必要的实验数据和安全性依据。

2 材料与方法

2.1 试验动物

健康 SD大鼠 (清洁级，第二军医大学动物房)10只，6～8周；新西兰白兔 (普通级，第二军医大学动物房)12只雌性 (未生产过)或雄性，体重2.0～2.2kg。

2.2 试验材料

HBC凝胶 (自制)；L929细胞株 (博谷生物有限公司)；MTS试剂 (Promega公司)；以下来自长征医院医学转化中心：DMEM；胰酶；苯酚；新生牛血清；甲醛；5%CO2培养箱(A-006，德国)；倒置荧光显微镜(CKX41)；酶标仪(ST-360)。

2.3 细胞毒性试验

将HBC凝胶放入DMEM培养液中，以1:4比例 (1单位体积HBC凝胶比4单位体积培养基)在37℃，5%CO2恒温培养箱下浸提24小时，吸取浸提上清液作为100%浸提液。再将100%浸提液用DMEM培养液稀释为25%、50%和75%浸提液。复苏L929细胞，提前进行细胞培养。用胰酶消化洗脱培养的L929细胞，将生长状态良好的1×104/mL的L929细胞加入96孔培养板中，每孔加入50 L细胞悬液，分别加入HBC凝胶25%、50%、75%、100%浸提液100 L/孔，阴性试验组加DMEM培养液100 L/孔，阳性试验组加含0.5%苯酚的细胞培养液100 L/孔。每组设10孔平行对照。放入37℃，5%CO2培养箱内培养。于1、2、4天，分别各取出1块96孔板放在倒置显微镜下观察，记录细胞生长情况后，于每孔加入 MTS试剂（5mg/mL）20 L，继续培养3小时后用酶标仪测定490nm处吸光度值。根据检查OD值计算各组细胞相对增值率(relativegrowthrate,RGR)。RGR=试验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100%。

根据医疗器械生物学国家评价标准[4]评定材料毒性程度：0级：RGR≥100%；1级：RGR为75%～99%；2级：RGR为50%～74%；3级：RGR为25%～49%；4级：RGR为1%～24%；5级：RGR为0%。0～1级为合格；2级可结合细胞形态、生长密度分析后综合评价；3～5级为不合格。

2.4 急性全身毒性试验

健康SD大鼠随机分成试验组、对照组各5只。试验组取大鼠尾缘静脉，注射生理盐水HBC凝胶浸提液50mL/kg，速度为0.1mL/s，对照组以相同速度注射生理盐水。记录注射前、1、2、3、4、5、7天大鼠的体重。并每日观察SD大鼠的毒性反应、活动状态、体重变化和死亡情况。

2.5 致热原反应试验

新西兰兔7只，以2.5mL/kg的剂量通过耳缘静脉注射，打入HBC浸提液，观察新西兰兔0.5、1、1.5、2、3小时的体温情况，通过肛门测量新西兰兔的体温，试验时避免刺激、惊吓动物，以免干扰体温测量结果。

2.6 皮肤刺激试验

新西兰兔5只，试验前24小时将HBC凝胶以1：4的比例放入0.9%的生理盐水，室温下浸提24小时，抽取上清液，即为HBC凝胶100%浸提液。另将新西兰兔背部去毛，两侧各形成5cm×20cm试验区。在新西兰兔背部取4个点，分别标记为1、2、3、4四个注射点，在每个注射点分别用1mL注射器注射0.2mL待测液，1号注射点皮内注射100% HBC浸提液，2号注射点皮内注射50%HBC浸提液，3号注射点皮内注射4%甲醛溶液 (阳性对照)，4号注射点皮内注射0.9%的生理盐水(阴性对照)，注射后20分钟、1小时、24小时观察记录注射后皮肤改变情况。根据表1记录皮内刺激反应评分和数字等级。[4]

表1 皮内刺激反应评分和数字等级

3 结果

3.1 细胞毒性试验通过24、48、96小时的培养，发现HBC浸提液，在24小时后，25%浸提液可明显促进L929细胞的生长，50%浸提液可相对促进L929细胞生长，75%浸提液、100%浸提液也可轻微促进L929细胞的生长。在48小时后，阴性对照组细胞生长状态良好，阳性对照组细胞死亡明显，25%浸提液组出现L929细胞凋亡，50%、75%、100%浸提液及阴性对照组细胞生长均良好。在96小时后，100%浸提液、75%浸提液组细胞增殖相对阴性对照组增强，25%浸提液组明显抑制 L929细胞生长，细胞进一步凋亡，阳性对照组细胞死亡，细胞形态模糊、仅保留细胞轮廓，具体结果如下表2。

表2 各浓度浸提液组不同细胞培养时间细胞相对增值率及毒性分级

96小时100%浸提液组/阴性对照组 117.8319 116.0647 99.41847 14.53526 9.088578 4 75%浸提液组/阴性对照组0 0 50%浸提液组/阴性对照组1 25%浸提液组/阴性对照组4阳性对照组/阴性对照组

以下为48小时后，高倍光镜下各组 L929细胞培养照片 (彩图见插页):

3.2 急性全身毒性试验注射后1～7天分别观察注射生理盐水组与注射HBC浸提液组，发现所有大鼠均无死亡，亦无惊厥、抽搐、食欲减退、呼吸抑制等毒性反应。注射完即刻，大鼠出现轻度烦燥不安，注射生理盐水组第2天体重降至注射前体重，第3日体重明显增加。注射HBC浸提液组第2天体重未恢复到注射前，从第4天体重开始正常增加，4～7天体重增加情况与阴性对照组无差异。以上述结果表明，HBC浸提液急性毒性试验为阴性。

3.3 致热原反应试验

表3 新西兰兔药物注射后体温变化如下

将HBC浸提液通过耳缘静脉打入新西兰兔体内，分时段测量其肛温，发现注射前后体温变化未超过±1℃，HBC浸提液不会引起新西兰兔体温升高，致热原反应试验阴性。

3.4 皮肤刺激试验 (表4)

24小时后100%HBC浸提液组、50%HBC浸提液组及阴性对照组皮丘均消失，外观和正常皮肤组织无差别，无发红、发白、水肿等不良反应，阳性对照组皮肤发生大小不等的干性坏死、苍白缺血，说明 HBC浸提液对皮肤无刺激，皮内刺激试验阴性。

表4 皮肤刺激反应评分和数字等级结果如下

4 讨论

壳聚糖 (CS)是一种碱性氨基多糖，具有无生物毒性、生物体可降解性、良好的黏附性和生物相容性等特点[5]。通过将壳聚糖羟丁基化后，不仅使其水溶性得到显著改善，使难溶于水的壳聚糖能溶解于水，而且创新性的引入了温敏性的属性，温度范围在20～34℃之间时可转变为水凝胶[6]。温敏型水凝胶是一种研究最多、应用最广的高分子水凝胶，其体积能随温度变化而变化，其特征是有一个临界的凝胶温度，聚合物链在这个温度下由于疏水作用而自发组装，发生相互分离。传统的温敏型水凝胶多以丙烯酰胺为原料，该物质具有一定的毒性且降解困难，使用时可能会给影响环境。天然大分子化合物壳聚糖具有较高的可降解性、对环境无污染等优点。因此，壳聚糖原性水凝胶引起国内外学者的广泛关注。

对于植入体内的羟丁基壳聚糖水凝胶是否对生物体有害，须首先检测其生物相容性。细胞生物相容性评价是测生物材料毒性的手段，具有简便、敏感性高、性评价的一项重要内容，已被广泛应用于生物相容性评价。近年来常用MTS (新型甲臜化合物)替代MTT法检测细胞毒性[7]。与MTT相比，MTS可直接进行比色，试验步骤简便，也大大提高了试验的敏感性，并且避免了添加二甲亚砜对细胞的不良影响。本试验选用小鼠成纤维细胞 (L929)，L929细胞是细胞毒性试验中应用最早及使用最广泛的细胞[8]。从L929细胞毒性试验结果可以发现阴性对照组和高浓度HBC浸提液组，细胞生长状态良好。培养4天过程无细胞死亡，细胞形态良好，生长正常。但是低浓度浸提液组及25%浸提液组细胞生长数量在第一个24小时后明显多于阴性对照组及高浓度浸提液组。48小时后，通过倒相差显微镜观察，25%浸提液组细胞大小明显变小，细胞核固缩，细胞质变少，细胞生长明显被抑制。第3天之后细胞凋亡，细胞核固缩，细胞结构保留。阳性对照组的 L929细胞如预期一样，全部死亡，细胞结构破坏，阴性对照组的细胞和高浓度浸提液组细胞如预期一样，生长良好。唯独25%浸提液 (低浓度)组细胞第1天生长加快，第2天出现凋亡，这一点与试验预期不同。分析原因可能是HBC作为一种新型壳聚糖衍生物，同样也具有传统壳聚糖"抑制成纤维细胞生长[9]"这一属性。刘万顺等研究壳聚糖复合物膜可抑制成纤维细胞生长并预防肌腱粘连[10]，壳聚糖及其衍生物被制作成防粘连膜应用于外科手术中，疗效明显[11,12]。可以推测HBC作为壳聚糖的新型衍生物同样可以在低浓度状态下诱导成纤维细胞凋亡，并且具有轻度防粘连的作用。假设HBC本身有细胞毒性，应该是浸提液浓度越高，细胞死亡越快，正好与试验结果相反，故假设不能成立，从而证明HBC无细胞毒性。

急性中毒试验意在检测 SD大鼠 LD50剂量，但由于HBC为胶体状，通过尾缘静脉注射无法大量注入胶体，故改为注射浸提液。浸提液中HBC溶解度较低，需要大量浸提液体注入大鼠体内方可将一定量的 HBC注入，故按照50ml/kg的比例注射大鼠尾缘静脉注射。如在短时间将内此剂量液体注入人体后，可引起循环功能衰竭，在大鼠试验中未观察到水中毒或其他毒性反应，但如将胶体凝胶注入大鼠体内，恐会引起静脉栓塞，故本试验由于给药方式的限制，无法测出大鼠的半数致死剂量。

皮肤刺激试验的目的是评价材料在试验条件下产生刺激反应的潜在性。刺激是不涉及免疫学机制的一次、多次或持续与试验材料接触所引起的局部炎症反应。在小动物体上进行的皮肤刺激试验有助于鉴别出人体皮肤和/或黏膜组织的潜在刺激物。一种原发性刺激物的特性是可产生炎症直接反应，即导致皮肤炎症病变或是重度刺激、皮肤水泡和/或坏死症状。大量使用家兔的皮肤刺激试验资料证实，家兔为优选试验动物。

通过以上试验，未得出羟丁基壳聚糖水凝胶有生物毒性的阳性结果，故可认为HBC水凝胶是一种生物相容性良好、安全可靠的新型温敏性水凝胶。

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The study of the biocompatibility of the Hydroxyl butyl chitosan

ChenYinsheng1,Hou Chunlin1,Wei Changzheng2,et a1.1 Department of Orthopaedics,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai,200003;2 Shanghai Qisheng Biological Agent Co.,Ltd.,Shanghai, 200003,China

Objective Tomake the bio-safetyassessmentof anew thermosensitive material,namedhydroxybutyl chitosan ,and to investigate the toxic and side effect of the material in vivo.Methods We hydroxyl butyl the chitosan into thermosensitive hydrogel,and use mouse embryonic fibroblast,L929.inverted microscope to observe the outcome of the experiment.Trailing edge intravenous injection of SD rats was done to complete acute toxicity test.Leach liquor was injectedinto NewZealandRabbitsearveinsto completethermaltest.Leach liquor was injectedintoNewZealand Rabbits skins to complete skin irritation test.Results All tests show that hydroxybutyl chitosan has no cytotoxicity,no skin irritation.It doesn't cause a high body temperature.Acute toxicity test find no animals dead or discomfort.Conclusion Hydroxybutyl chitosan has good biocompatibility.As a safe biomaterial,it will hopefully become a new drug carrier.

Hydroxybutyl chitosan;Thermosensitivity;Thermosensitivity

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.03.004

swgk2015-02-0024

*课题项目：国家863课题(2014AA093606)

l第二军医大学附属长征医院骨科，上海200003；2上海其胜生物制剂有限公司，上海200003