周发为

445000湖北民族学院附属民大医院检验科

铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制分析

周发为

445000湖北民族学院附属民大医院检验科

目的：了解铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。方法：选取临床分离的铜绿假单胞菌89株，采用纸片扩散法行药敏试验、紫外线吸收法行膜微孔蛋白oprD2基因测定、纸片协同试验测定金属β-内酰胺酶，同时采用Etest试验了解氰氯苯腙对亚胺培南最低抑菌浓度的影响。对所有试验结果进行统计分析。结果：耐药铜绿假单胞菌菌株oprD2含量明显低于敏感铜绿假单胞菌菌株(P＜0.05)；且有耐药铜绿假单胞菌菌株产生β-内酰胺酶；同时还有耐药铜绿假单胞菌菌株存在主动外排泵出机制。结论：oprD2含量降低、β-内酰胺酶产生、主动外排泵出机制是导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要作用机制。

铜绿假单胞菌；亚胺培南；耐药机制

铜绿假单胞菌是导致医院内获得性感染的常见菌种之一，近年来耐药率不断地在增加，尤其是对亚胺培南的耐药[1-2]，给患者的救治造成严重影响。本研究对临床分离的89株铜绿假单胞菌菌株进行有关分析，旨在探讨铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。

资料与方法

菌株来源：2013年1月-2014年3月住院患者的痰、尿液等标本89株，分离得菌株。所有入选菌株均经全自动微生物分析仪和GNI+鉴定卡进行检测，并确认。

方法：对89株菌株均进行药敏试验、膜微孔蛋白oprD2基因测定等检测。具体操作方法：①药敏试验：采用纸片扩散法，按常规操作流程进行细菌的培养和鉴定。采用美国临床实验室标准化委员会颁布的标准对结果进行判读。②膜微孔蛋白oprD2基因测定：采用外膜蛋白图、紫外线吸收法进行测定。从M-H琼脂平板上选取单个铜绿假单胞菌菌落置入20 mL LB肉汤中，充分震荡后留置15～20 h。取1.5 mL培养液重新置入到30 mL LB肉汤中留置20 h。以7 500 r/min，温度4℃离心10 min后，使用磷酸盐缓冲液(pH值7.0)冲洗2次。后置冰浴超声破菌，每50 s停15 s，连续5次。再次以5 000 r/min，温度4℃离心10～15 min，取上清液。将沉淀颗粒悬浮于10 mmol/L磷酸盐缓冲液，常温中放置30 min后，以30 000 r/min，常温离心30 min，去掉上清液后，使用1%的十二烷基肌氨酸钠冲洗2次，提取外膜蛋白悬浮于10 mmol/L磷酸盐缓冲液中，经紫外线吸收法测定oprD2含量。③β-金属酶测定：采用纸片协同试验进行检测。具体操作方法：选用0.5麦氏单位的培养液均匀涂抹于M-H琼脂平板上，中间贴10 g亚胺培南，并在距离纸片1.5～2.5 cm处另贴1张空白纸片，加入3μL[A1]2-羟基乙醇原液，35℃环境中过夜，若靠近2-羟基乙醇原液侧的亚胺培南抑菌环有扩大，则提示β-内酰胺酶产生。④氰氯苯腙对亚胺培南最低抑菌浓度的影响；采用Etest试验进行测定，具体操作：配制水解络蛋白M-H琼脂和含浓度5 mg/L的氰氯苯腙的M-H琼脂平皿。选取2～3个过夜培养的菌落，注入0.9%氯化钠注射液调节至0.5麦氏单位。依照K-B法涂布菌混悬液和贴Etest试剂，放入35℃环境中培养24 h，了解氰氯苯腙对亚胺培南最低抑菌浓度的逆转作用。当氰氯苯腙存在时，亚胺培南的最低抑菌浓度比缺乏时，相应的最低抑菌浓度下降至25%时，提示存在主动外排泵出机制。

统计学处理：数据由SPSS 13.0数据分析软件处理而得，计量资料用(±s)表示，差异性比较采用t检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结果

药敏试验结果：纸片试验显示89株菌株中有36株对亚胺培南耐药，另53株则提示为敏感。

oprD2基因含量：耐药的36株菌的oprD2基因含量明显低于敏感的53株，见表1。

β-内酰胺酶36例耐药菌株中共检出β-内酰胺酶5株，检出率13.88%。

主动外排泵出机制：36例耐药菌株中氰氯苯腙存在使亚胺培南最低抑菌浓度下降的菌株共7株(19.44%)。

表1 耐药菌株与敏感菌株oprD2基因含量(±s)

表1 耐药菌株与敏感菌株oprD2基因含量(±s)

组别 oprD2基因含量 t P耐药菌(n=36) 2.13±0.82 9.7409 ＜0.05敏感菌(n=53) 4.05±0.97

讨论

铜绿假单胞菌是导致人体局部和全身性感染的常见原因，而亚胺培南是治疗的首选[3]，但耐药性有增加。本研究结果显示oprD2含量降低、β-内酰胺酶、主动外排泵出机制存在是铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药机制。外膜膜微孔蛋白oprD2是目前铜绿假单胞菌扩散的唯一特异性通道，其降低可导致药物难以进入菌体，从而使作用减弱，逐渐形成耐药；β-内酰胺酶大部分由质粒介导，极易在不同的菌株间进行传播，其可导致铜绿假单胞菌的爆发流行；主动外排泵出机制有控制抗菌药物进出细胞和转运抗菌药物的作用，而氰氯苯腙能导致转运蛋白失去能量供应而抑制亚胺培南最低抑菌浓度，降低其抑菌效果。

总之，oprD2含量降低、β-内酰胺酶产生、主动外排泵出机制是导致铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要作用机制。

[1]李杰,苏维奇.耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药特征及其耐药机制研究[J].中国实验诊断学,2011,15(3):475-477.

[2]余广超,徐霖,袁广卿,等.亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检测[J].中国抗生素杂志,2011,36(3):223-227.

[3]李小靖,陈武嘉,钟燕玲,等.对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌药敏情况分析[J].中国医药科学,2012,2(14):106-107.

表1 两组治疗前后精液质量比较

表2 两组治疗前、治疗后6个月性激素水平比较(±s)

表2 两组治疗前、治疗后6个月性激素水平比较(±s)

注：★表示与同组治疗前比较，P＜0.05；▲表示与对照组同时期比较，P＜0.05。

组别 时间 FSH(IU/L) LH(IU/L) T(mg/L)观察组 治疗前 13.35±3.75 18.27±1.75 3.13±0.91治疗后6个月 8.99±1.93★ 5.50±1.89★ 7.21±1.78★▲对照组 治疗前 14.13±1.38 17.82±3.59 2.29±0.75治疗后6个月 9.48±1.23★ 8.44±1.28★ 4.57±1.26★

结果

两组患者精子质量比较：两组患者治疗后的精子质量明显优于治疗前，观察组治疗后的精子质量改善效果明显优于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

两组性激素水平比较：两组患者治疗后的性激素水平明显优于治疗前，观察组治疗后的性激素水平改善效果明显优于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

讨论

VC伴不育的机制是多种多样的，从不同的角度有不同的解释，现阶段最新研究证实，氧化应激反应可能是其主要的机制之一。其在分子水平的研究还在进行当中，有可能会开辟VC伴不育诊疗的新途径[2]。β胡萝卜素是一种临床常用的抗氧化剂，β胡萝卜素通过干扰光敏氧化和作为还原剂保护脂质并清除自由基。为了探索这方面的临床疗效，笔者观察了克罗米芬联合β胡萝卜素对VC伴不育高位结扎术后患者精子质量和性激素水平的影响，为开创新的治疗途径积累了一些临床经验。结果显示，两组患者治疗后的精子质量明显优于治疗前，观察组治疗后的精子质量改善效果明显优于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)；两组患者治疗后的性激素水平明显优于治疗前，观察组治疗后的性激素水平改善效果明显优于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。此结果说明，克罗米芬联合β胡萝卜素对精索静脉曲张伴不育高位结扎术后精子质量和性激素水平均有所提高，大大增加了受孕几率。

综上所述，抗氧化剂确实可以联合用药，提高了VC伴不育的治疗效果，在临床上收到了很好的效果，为治疗VC伴不育开创了新的途径和治疗思路。但此次研究结果只是临床上很少有的数据，还需大量的此方面的研究进行支持，特别是阐明其作用的确切机理的基础研究。

参考文献

[1]张秋养,邱曙东.与精索静脉曲张相关不育的机理研究[J].现代泌尿外科杂志,2004,9 (3):184-186.

[2]孙成亮.小切口集束型腹膜后精索静脉高位结扎术在精索静脉曲张伴不育患者中的应用[J].湖北民族学院学报(医学版), 2012,(1):30-32.

Analysising of the mechanism of imipenem resistant pseudomonas aeruginosa

Zhou Fawei
Department of Inspection of Minda Hospital,Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities 445000

Objective:To understand the mechanism of imipenem resistant pseudomonas aeruginosa.Methods:89 strains of clinical isolates of pseudomonas aeruginosa were selected.Disk diffusion method was used for drug sensitivity test,ultraviolet absorption method for the determination of microporous membrane protein oprD2gene,disk synergy test determination ofβ-metal enzyme, while understanding the effect of cyanide chlorophenylhydrazone on imipenem minimum inhibitory concentration by using Etest test.Results:oprD2resistant pseudomonas aeruginosa strains were significantly lower than the sensitive strain of pseudomonas aeruginosa(P＜0.05),and drug resistant pseudomonas aeruginosa strains produceβ-metal enzyme;at the same time there are drug resistant pseudomonas aeruginosa strains existactive efflux pump mechanism.Conclusion:Decreased the content of oprD2, β-metal enzyme producing,active efflux pumpmechanism were the main mechanism resulting in pseudomonas aeruginosa resistantto imipenem.

Pseudomonas aeruginosa;Imipenem;Resistance mechanisms

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.6.2