陈文杰，殷嫦嫦，虞蕾琳，李忠友，殷 明

(1.南昌大学 研究生院医学部, 江西 南昌 330006；2.南昌大学第二附属医院 骨科, 江西 南昌 330006；3.九江学院 九江市转化医学重点实验室, 江西 九江 332000；4.九江市中医院, 江西 九江 332000)

骨损伤尤其是骨折是临床的常见病、多发病，由于缺乏骨再生，即使是轻微骨折也会导致患者的预后不佳。据报道，由于骨再生不足，2%～10%的骨折会发展成骨不连[1]。因此如何加快骨折愈合、促进骨再生是目前迫切需要解决的问题。然而，现今的治疗“金标准”：自体骨和同种异体骨移植可能会导致很多并发症。因此，当务之急是找到一种有强大成骨能力且并发症发生率低的治疗方法。外排体的成骨能力强、安全性好，这为骨再生提供了一种新的治疗方法。

1 骨再生中各类细胞的分工合作

骨是高度血管化的组织，依赖血管和骨细胞之间的密切连接来保持骨骼的完整性，在骨骼发育和骨折修复中，血管生发十分重要。此外破骨细胞溶解吸收骨，而骨细胞合成新骨; 骨再生是成骨细胞和破骨细胞的数量和活动动态平衡的结果，骨重建位点释放细胞因子，募集破骨细胞，成骨细胞继续分化，基质成熟并矿化，骨表面恢复后，成熟的成骨细胞凋亡或最终分化为成骨细胞，其嵌于钙化基质中响应机械应力[2]。骨再生分为两种:膜内成骨和软骨内成骨[3]。膜内成骨是直接通过间充质干细胞向成骨细胞分化导致骨骼钙化，而软骨内成骨比较复杂，通过软骨细胞调节骨骼的生长和形成，软骨细胞中心的软骨停止增殖,开始扩大，合成和释放X型胶原蛋白质,肥厚性软骨细胞进行矿化、诱导血管渗透、成骨分化及迁移。除了成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞，内皮细胞对骨再生也有重要的作用。聚集的内皮细胞能分泌VEGF并且指导软骨细胞消化周围的细胞基质,最终软骨细胞凋亡、血管和骨母细胞渗透入细胞基质共同促进骨的生长[4]。此外，骨再生和血管再生是密切相关的，血管再生受损会导致骨再生受损。血管内皮细胞Notch基因敲除后不仅血管生成减少了，骨密度和骨质量也会减少[5]。之前对骨再生的研究主要是针对细胞功能，而细胞间的物质传递很少有人涉及。但是，细胞间的物质传递对骨再生影响很大。因此，如果能发现一种增加成骨细胞形成和加强细胞间物质传递的治疗方法，在未来的临床治疗中将会起到重要作用。外排体，有上述两种作用，这使之成为研究的热点。

2 外排体的特性

外排体，来源于内吞作用的一种小囊泡，是一种由真核细胞分泌到细胞外的、直径约30～100 nm的膜性小囊泡，含有其来源细胞的胞膜、蛋白质、mRNA和微小RNA(miRNA)等成分，通过与邻近的细胞膜融合进而将一个细胞的胞内物质传递到另一个细胞，从而在不同细胞间进行信息传递[6]。外排体表面蛋白质TSG101、CD9、CD63、CD81和CD82实现了囊泡与靶细胞膜的连接[7]。外排体传递的物质很广泛，外排体分泌的蛋白质和RNA对调节受体细胞功能来说是最重要的,外排体中的miRNA在调节细胞定向分化和活性中发挥了关键的作用[8]。光谱法数据表明外排体中有超过4 000种蛋白质，尽管不同来源的外排体蛋白质的功能不尽相同，但有些蛋白质是所有外排体所共有的。这些共有的蛋白质是细胞间物质传递相关蛋白质，如HSP70和HSP90是所有外排体蛋白质运输的关键蛋白质[9]。

3 外排体促进各种器官和组织的再生

外排体的再生作用已经在其他组织和器官中被证实了。经过外排体治疗的器官功能明显改善：在心肌梗死小鼠模型中，经过外排体疗法的小鼠心室重构和左心室射血分数可见明显的改善[10]；外排体能调节细胞功能，从而促进其再生，在肺动脉高压的小鼠模型中，外排体疗法抑制了病情的进展并且通过细胞保护作用避免了肺损伤；外排体还能促进神经细胞和皮肤再生[11]。外排体不仅能减少细胞的凋亡还能延长细胞的生存周期。这些研究为外排体疗法奠定了基础并为探究其在骨再生中的作用提供了参考。

4 外排体调节骨再生

4.1 外排体调节间充质干细胞的成骨分化

外排体直接调节间充质干细胞的成骨分化。间充质干细胞来源的外排体能诱导干细胞分化为成骨细胞系[12]。研究表明间充质干细胞来源的外排体在成骨分化过程中9种miRNAs (let- 7a、miR- 199b、miR- 218、miR- 148a、miR- 135b、miR- 203、miR- 219、miR- 299- 5p和miR- 302b)的表达上调，5种miRNAs(miR- 221、miR- 155、miR- 885- 5p、miR- 181a和miR- 320c)的表达下调，所有这些miRNA在成骨分化中均起到一定的作用[13]。同时，成骨细胞也能分泌外排体，对骨生长起到正反馈作用，成骨细胞来源的外排体极大的促进了成骨分化，通过抑制Axin1来激活Wnt信号通路，最终促进间充质干细胞的成骨分化[14]。成骨细胞来源外排体中的真核起始因子2也能诱导间充质干细胞分化为成骨细胞[15]。免疫系统和造血系统对骨生长有重要的作用，尽管具体的机制还不清楚，但外排体在此过程中可能也起到了一定的作用。树突细胞和单核细胞来源外排体通过传递miRNA显著地增加了间充质干细胞的成骨分化。然而，哪种细胞来源的外排体促成骨作用最强以及外排体如何调节间充质干细胞的成骨分化仍有待研究。

4.2 外排体调节成骨细胞增殖和活性

骨中约4%～6%的细胞为成骨细胞，其主要功能是促进骨的形成。在骨形成过程中，成骨细胞产生钙磷基矿物进而形成矿化骨。外排体通过调节成骨细胞的增殖和活性来刺激骨再生。前列腺癌细胞来源的外排体有更强的骨亲和性，使成骨细胞增殖加快，用该细胞来源外排体处理过的成骨细胞能产生更多的钙沉积和更高的ALP(碱性磷酸酶)活性[16]。外排体在体内对成骨细胞的作用也很显著，骨髓间充质干细胞来源外排体治疗后的颅骨缺损兔模型的骨愈合也明显改善[17]。体内和体外实验进一步印证了外排体对成骨细胞的重要性。

4.3 外排体调节破骨细胞成熟和活性

骨再生和破骨细胞的异常激活是密切相关的。肿瘤细胞通过分泌外排体增加成熟破骨细胞的数量和活性，从而诱导骨溶解。多发性骨髓瘤来源的外排体通过Raw264.7细胞系和人原始破骨细胞的内化增加破骨细胞标志物(cathepsin K, metalloproteinases 9和 TRAP)的表达，从而促进破骨细胞的成熟[18]。前列腺癌来源的外排体能通过刺激NF-κB(RANK)受体活化剂的表达来增加破骨细胞生成[19]。成熟破骨细胞也能通过分泌外排体进行自身调节，破骨细胞来源的外排体中NF-κB高表达，抑制外排体中NF-κB表达后会导致破骨细胞形成受到抑制[20]。

4.4 外排体促血管生成

尽管没有研究直接证明外排体在骨中有促血管生成作用，但外排体在其他组织和器官中能刺激血管生成。胚胎间充质干细胞来源的外排体在体外能促进内皮细胞增殖和血管形成，此外还能通过NADH氧化酶、基质金属蛋白质酶和细胞外基质金属蛋白质酶诱导因子来增加内皮细胞增殖和血管形成[21]。外排体不仅能在体外促进血管生成，在体内也能增加血管生成能力。间充质干细胞来源的外排体在不同的动物模型中均能提高血管生成能力。尾静脉注射间充质干细胞来源的外排体能减少心肌缺血和再灌注损伤，在缺血性心脏病动物模型中能提高血管生成能力[22]。

5 外排体疗法的优势与不足

5.1 外排体疗法的优势

与细胞治疗相比，外排体疗法有很多优势。外排体疗法能避免生物治疗所带来的细胞毒性和免疫抑制问题[23]。外排体能同时正向和负向调节免疫反应，间充质干细胞来源的外排体对宿主有免疫豁免特性。胶质瘤来源的外排体能激活免疫反应以便于识别胶质瘤细胞，很大程度上有助于新型免疫治疗的发展[24]。另外，和细胞移植相比，外排体疗法的并发症(肿瘤、血栓形成和GVDH)更少，安全性更强。

5.2 外排体疗法的不足

外排体疗法应用于临床仍有很多限制。首先分离外排体的方法产量很低，5×106个骨髓瘤细胞仅能提供5～6 μg外排体；第二，分离外排体的方法仍然很有争议，传统超高速离心法操作费时，提取外排体样本回收率较低，而ExoQuick与TEI试剂盒提取方法仅适用于血清等稀缺样本外排体制备[25]。但所有这些方法均不适用于临床；第三，外排体所携带基因信息的确切功能还不明确。外排体中miRNA是其主要的功能成分，来源不同，外排体携带的物质也不同。了解注射外排体后其在体内的分布对减小外排体的不良反应至关重要，大部分外排体会迁移到骨和肺。因此，必须明确外排体的分布和清除，从而更好的评估其安全性。

6 问题与展望

外排体能刺激成骨细胞生成、调节血管再生和破骨细胞的活性，在体内和体外均能有效的促进骨再生。但是由于不同来源的外排体作用不一，对靶细胞的具体作用机制不清楚；体外分离产量低以及安全性等问题限制了其在临床上的应用。因此需要进一步研究外排体在骨再生中具体的作用机制，开发出有效提取和纯化外排体的方法，并探究哪种细胞和组织来源的外排体其成骨能力最强。由于现今治疗骨再生的方法费用高、并发症多和疗效差，外排体疗法将在骨再生临床治疗中开辟新的领域。

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