黄 黎 周丽珍

(泸州医学院免疫教研室，四川 泸州 646000)

Toll样受体(TLRs)属于天然免疫识别受体，能够直接或间接结合病原体，经吞噬及内化将病原体及其产物清除出去，是抵抗外来病原微生物入侵的第一道防线，在保护牙本质及牙髓组织健康中发挥重要作用〔1〕。已有报道指出TLR4在牙髓抵抗外来病原微生物入侵的宿主免疫防御中起到重要作用，而作为同一家族的TLR1是否有相似功能尚未可知。为此，本研究通过了解TLR1在人牙髓组织及成牙本质细胞层中的表达及分布，探讨TLR1在牙髓牙本质复合体免疫防御中的作用。

1 资料和方法

1.1 一般资料 研究对象为本院口腔外科门诊就诊患者，年龄60～65岁，实验组为临床诊断为牙髓炎、需要拔除第三磨牙的患者，纳入标准为牙体有深龋且有温度刺激痛或自发痛但无牙周病的第三磨牙。对照组为牙体阻生需要拔除第三磨牙的患者，纳入标准为牙体完整无龋病及牙周病的第三磨牙。两组各获得第三磨牙30颗，研究获得所有患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色观察健康牙髓及炎症牙髓TLR1的分布从牙颈部将牙冠劈开后取出牙髓固定24 h，后置于30%蔗糖溶液48 h。取出牙髓后包埋，利用恒冷冰冻切片机制成10μm切片，然后黏片、脱蜡，再用市售TLR1抗体(Santa cruz公司)进行免疫组化染色，观察TLR1的表达及分布情况。

1.2.2 RT-PCR技术检测健康牙髓及炎症牙髓TLR1 mRNA的表达 从牙颈部将牙冠劈开后取出牙髓，提取组织及细胞总RNA，测定纯度定量后按照逆转录试剂盒说明书(QIAGEN公司)逆转录合成cDNA，再以TLR1引物为模板进行PCR，检测牙髓中TLR1 mRNA的表达。

1.2.3 Western印迹技术检测健康牙髓及炎症牙髓的TLR1蛋白 从牙颈部将牙冠劈开后取出牙髓，提取总蛋白，行蛋白电泳，转膜，封闭，一抗孵育及二抗孵育后，最后进行TLR1蛋白的检测。

2 结果

2.1 TLR1在牙髓组织的免疫组织化学染色 免疫组织化学法发现对照组即健康牙髓组织成牙本质细胞层TLR1阳性表达，部分牙髓内血管可见环状着色，血管内存在阳性细胞(图1A);牙髓内部未发现或偶尔有TLR1阳性细胞(图1B)。而观察组即牙髓炎患者牙髓内部可见TLR1强阳性表达(图1C)。

2.2 Western印迹检测TLR1的表达 Western印迹分析后发现观察组和对照组牙髓及成牙本质细胞标本均于相对分子质量89 kD的位置有阳性条带出现。见图2。

图1 TLR1在牙髓组织的免疫组织化学染色

图2 Western印迹检测TLR1的表达

2.3 TLR1 mRNA的表达 对两组患者牙髓组织及成牙本质细胞标本总RNA进行RT-PCR，行琼脂糖凝胶电泳发现观察组和对照组标本在278 bp的位置均有条带出现，与预期扩增产物大小类似。

3 讨论

TLRs 是白介素-1受体(IL-1R)超家族成员，是人类进化中高度保守的分子家族，该类受体具备多种生物学功能:如可促进细胞因子的合成与释放、诱发炎症反应及抗病毒感染;还可诱导一氧化氮(NO)依赖性杀菌活性，促进免疫细胞表面表达相关免疫分子，促使免疫细胞的成熟等〔2，3〕。有研究发现，由TLRs诱导的非特异性免疫与感染、肿瘤及自身免疫性疾病密切相关，被认为是特异性免疫的启动器〔4，5〕。人体包括口腔在内的各器官组织均存在TLRs，故对TLRs进行深入研究可为今后探索疾病的发病机制提供另一思路，对于临床预防和治疗疾病具有重要意义〔6，7〕。

TLR1是TLRs的重要组成之一，有报道指出TLR1广泛分布于单核细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞等多种免疫细胞，可识别多种微生物中脂蛋白等分子模式，并通过TLR1/2异二聚体刺激免疫应答，与人类多种疾病的发病密切相关〔8～10〕。在口腔炎症免疫方面，当前对TLRs研究较清楚的是TLR4和TLR2，而有关TLR1蛋白是否在牙髓组织表达、其表达情况与牙髓组织炎症免疫有何种关系，国内尚无相关报道。

本组研究中免疫组化结果表明在正常牙髓血管内皮细胞、血管周围及血管内均存在TLR1免疫反应阳性细胞，而PR-PCR结果亦表明正常牙髓组织有TLR1表达，可能与取出的牙髓组织中存在成牙本质细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞等可表达TLR1的免疫细胞有关，由此可认为TLR1在牙髓组织免疫应答过程中起到较大作用，可能通过诱发免疫应答从而引起血管内皮细胞等免疫细胞活化以避免病原微生物入侵。另外，免疫组化发现牙本质细胞质及突起以及位于成牙本质细胞层附近的树突细胞膜及胞质均有TLR1表达，且发现在正常牙髓组织中成纤维细胞并未表达TLR1，牙龈及牙周膜成纤维细胞同牙髓成纤维细胞存在相似性，但观察组牙髓组织的牙髓成纤维细胞TLR1则强阳性表达，与既往对TLR4的研究结果类似，提示TLR1表达与细胞分布部位及功能状态相关〔7〕。正常状态下牙髓成纤维细胞因为有成牙本质细胞包绕故不会受病原微生物刺激，但当牙本质被破坏后，牙髓成纤维细胞因外界病菌侵入就可能会活化并表达TLR1。

综上所述，本研究发现牙髓组织中TLR1的表达情况与细胞分布、功能状态等密切相关，具有和TLR4相似的时空特异性，在正常情况下战略性分布于成牙本质细胞及牙髓内部血管周围，为抵御外来病原微生物入侵做好准备，在牙髓及牙本质免疫复合体免疫防御反应中发挥重要作用。

1 闫 浩，李 妍，马美娟，等.胰岛素在巨噬细胞泡沫化过程中对Toll样受体4表达的影响及其机制〔J〕．现代生物医学进展，2013;13(9):1605-8，1604.

2 Khoo JJ，Forster S，Mansell A.Toll-like receptors as interferon-regulated genes and their role in disease〔J〕．J Interferon Cytokine Res，2011;31(1):13-25.

3 Kutikhin AG.Association of polymorphisms in TLR genes and in genes of the Toll-like receptor signaling pathway with cancer risk〔J〕．Hum Immunol，2011;72(11):1095-116.

4 Alexopoulou L，Desnues B，Demaria O.Toll-like receptor 8:the awkward TLR〔J〕．Med Sci(Paris)，2012;28(1):96-102.

5 Lee NY，Lee HY，Lee KH，et al.Vibrio vulnificus IlpA induces MAPK-mediated cytokine production via TLR1/2 activation in THP-1 cells，a human monocytic cell line〔J〕．Mol Immunol，2011;49(1-2):143-54.

6 Lancioni CL，Li Q，Thomas JJ，et al.Mycobacterium tuberculosis lipoproteins directly regulate human memory CD4(+)T cell activation via Tolllike receptors 1 and 2〔J〕．Infect Immun，2011;79(2):663-73.

7 Oosting M，Ter Hofstede H，Sturm P，et al.TLR1/TLR2 heterodimers play an important role in the recognition of Borrelia spirochetes〔J〕．PLoS One，2011;6(10):e25998.

8 Plantinga TS，Johnson MD，Scott WK，et al．Toll-like receptor 1 polymorphisms increase susceptibility to candidemia〔J〕．J Infect Dis，2012;205(6):934-43.

9 Dasari P，Zola H，Nicholson IC，et al.Expression of Toll-like receptors by neonatal leukocytes〔J〕．Pediatr Allergy Immunol，2011;22(2):221-8.

10 Zhu J，Krishnegowda G，Li G，et al.Proinflammatory responses by glycosylphosphatidylinositols(GPIs)of Plasmodium falciparum are mainly mediated through the recognition of TLR2/TLR1 〔J〕．Exp Parasitol，2011;128(3):205-11.