烘箱煨制雷公藤药效毒性及成分变化研究

2015-04-26刘建群张国华高俊博

亚太传统医药 2015年10期

关键词：生药烘箱佐剂

刘建群，张国华，高俊博

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330004)

烘箱煨制雷公藤药效毒性及成分变化研究

刘建群，张国华，高俊博

(江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌 330004)

目的：研究烘箱煨制雷公藤的药效、毒性及成分变化。方法：采用黄泥包裹雷公藤带皮根药材，烘箱加热煨制得雷公藤煨制品。分别采用大鼠佐剂性关节炎模型、小鼠急性肝损伤模型及高效液相色谱法评价雷公藤煨制品抗炎活性、急性毒性以及成分变化。结果：雷公藤经过150℃和200℃烘箱加热煨制后治疗佐剂性关节炎效果显著提高，优于生药，肝毒性显著下降。雷公藤经烘箱煨制后，4个成分含量下降，1个成分含量增加，新产生成分2个。结论：首次报道了烘箱煨制对雷公藤的药效、毒性及成分的影响。烘箱煨制对雷公藤具有确切的减毒增效作用，可大大提高雷公藤的临床应用安全性，值得推广应用。

雷公藤；烘箱煨制；药效；毒性；有效成分

类风湿性关节炎属于严重危害人们健康的十类重大疾病之一，发病率高、危害严重、治愈率低[1]。雷公藤(TripteryginumWilfordii) 系卫茅科植物，味辛、苦，性凉，有大毒，归心、肝、脾、肾经，具有清热解毒、祛风除湿、舒筋活血通络、消肿止痛、杀虫止痒之功。雷公藤是公认的具有良好疗效的治疗类风湿性关节炎等自身免疫功能亢进性疾病的首选中药，疗效显著[2-3]。但是雷公藤毒性很大，具有肝、肾、心、消化系统、生殖系统等毒性，是目前不良反应报道最多的中药之一[3]。炮制是有毒中药降低毒性的传统有效方法，目前，关于雷公藤的炮制方法主要有净制法[4]、煮法[5-6]、炙法[6]、蒸法[6-8]、浸泡法[9]及其他炮制方法[10]。净制法去掉了毒性最大但也是活性最大的根皮，该法虽然降低了毒性但同时降低了雷公藤的治疗效果，造成资源大大浪费。上述炮制方法虽然对雷公藤的毒性有一定的降低效果，但多数文献未对雷公藤炮制品和生品的药效进行对比研究，而且采用的药材绝大多数为去皮净制的雷公藤药材。目前，有关雷公藤炮制研究比较薄弱，缺少抗炎、免疫抑制等活性对比研究，雷公藤许多现有炮制方法疗效还未明确，探索雷公藤炮制物质基础变化的文献报道也较少，缺少带皮雷公藤药材的炮制研究。煨制是常用炮制方法之一，具有“缓和药性、增强疗效”的作用。本文首次报道了烘箱煨制对雷公藤带皮根药材的毒效及其化学成分的影响，丰富了雷公藤炮制方法。烘箱煨法炮制减毒增效效果好，而且利用雷公藤的带皮根药材，资源利用充分，炮制过程简便，工艺可控性强，容易规范化和推广，具有重要的实际应用价值。

1 材料与仪器

雷公藤根于2011年采自江西省萍乡市，原植物由作者刘建群教授鉴定为雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.F.)。雷公藤甲素对照品(购自南京泽朗医药科技有限公司，纯度>99%，批号ZL110619)，甲醇(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)，水为二次蒸馏水，中性氧化铝(分析纯，上海纳辉干燥试剂厂)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)，完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司产品)。其余试剂为分析纯。

昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g，由江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(赣)2011-0001。健康SD雄性大鼠，体重(220±15)g。由湖南斯莱克景达动物有限公司提供SCXK(湘)2013-004。

Agilent1200高效液相色谱仪(四元泵、柱温箱、VWD检测器和Agilent 1200 色谱工作站)；十万分之一分析天平(AE-240，瑞士梅特勒)；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；R-201旋转蒸发仪(厦门精艺兴业科技有限公司)，Z-16K型高速低温离心机(美国Sigma公司)，SABA PM4000全自动生化分析仪(意大利AMS公司)。YLS-7B足趾容积测量仪(济南益延科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 雷公藤烘箱煨制

将雷公藤带皮根药材均分为3份，每份40g，分别为生药组、150℃烘箱煨制组和200℃烘箱煨制组。烘箱煨制组药材用黄泥( 将黄土与10%食盐水按每4g黄土中加入1mL食盐水的比例和匀) 均匀包裹，包层厚度约0.3cm，分别置于150℃和200℃的烘箱中煨制45min，剥离黄泥，即得。

2.2 雷公藤提取物制备

将生药组、烘箱煨制组药材，切碎，采用10倍量70%乙醇回流提取3次(1.5h、1.5h和1h)，提取液合并浓缩，减压蒸干得到各组雷公藤提取物。

2.3 药效试验动物分组及处理

采用大鼠佐剂性关节炎模型评价雷公藤生药与煨制品的治疗作用。动物适应性饲养1周后，将大鼠随机分为5组，分别为空白组、模型组、雷公藤生药组、150℃烘箱煨制组和200℃烘箱煨制组，每组10只，造模前测右后足容积，而后除对照组外，其余各组左后足皮内注射0.1mL完全弗氏佐剂造模，对照组注射等量生理盐水。自致炎第12天起开始给药每天1次，雷公藤和各炮制组给药剂量为4.5g/kg(剂量均按生药计)，连续12天，并测定右后足容积，每4天测1次，分别为第12、16、20、24、28天，并在致炎后第12、16、20、24、28天观察并记录四肢关节病变程度，测量继发侧足肿胀体积△V。

2.4 毒性试验动物分组及处理

取昆明种小鼠40只，18～22g，雌雄各半，实验室适应喂养1周后，随机分为4组，每组10只，分别为空白对照组、生药组、150℃烘箱煨制组和200℃烘箱煨制组。生药组烘和箱煨制组分别给予相应雷公藤提取物，对照组给予等量蒸馏水。给药前，小鼠禁食过夜，自由饮水，给药组分别于次日灌胃给药1次，6h后再灌胃给药1次，给药剂量为16.25g/kg(按生药计)。第二次给药18h后小鼠眼眶取血，3 500r/min离心10min得血清，按试剂盒操作说明生化分析仪检测ALT 和AST水平。

2.5 统计学方法

2.6 高效液相色谱分析

2.6.1 供试样品制备将上述生药组、150℃和200℃烘箱煨制组提取物，用甲醇溶解并定容至50mL。精密量取1mL，上中性氧化铝柱(2g，粒度160～200目，内径1.2cm，5mL洗脱剂预洗)，用20mL含5%无水乙醇的氯仿溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至1mL，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。

2.6.2 液相色谱条件 Diamonsil C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为甲醇∶水(45∶55)，流速为1mL/min，检测波长为218nm，柱温为35℃，进样方式为手动进样，进样量为20μL。

3 结果

3.1 治疗佐剂性关节炎试验结果

结果(表1)表明，生药组、150℃烘箱组和200℃烘箱组小鼠与模型组侧足肿胀体积比较，P均<0.05，说明这3组与模型组存在明显差异，治疗效果显著，150℃和200℃烘箱煨制品治疗效果均优于生药。其中200℃烘箱组跟空白对照组比较无显著差异，数据显示在12天时小鼠有明显足肿胀，而后逐渐消退恢复，说明200℃烘箱组的治疗效果最为理想。

表1 烘箱煨制对雷公藤治疗大鼠佐剂性关节炎药效的影响 (±s，n=10)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，ΔP<0.05；与生药组比较，#P<0.05。

3.2 肝功能检测结果

从表2可以看出，雷公藤生药组、150℃烘箱煨制组和200℃烘箱煨制组小鼠ALT和AST水平均比正常对照组高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明雷公藤及其炮制品有一定的肝毒性。烘箱煨制组小鼠ALT和AST水平均比生药组低，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明雷公藤烘箱煨制组毒性比生药组低，而且随着炮制程度的增加肝毒性下降。

3.3 高效液相色谱分析

雷公藤生药组和烘箱煨制组药物HPLC色谱图见图1，比较色谱图的对应色谱峰面积可以看出，雷公藤在烘箱煨制后，4个成分含量下降，为色谱峰2、3、5和6，保留时间tR分别为11.51、13.56、18.33和30.63min，其中色谱峰5下降幅度最大，烘箱煨制后几乎消失，根据对照品确定色谱峰2为雷公藤甲素，说明烘箱炮制后雷公藤甲素稍有下降。一个成分含量增加，为色谱峰4，保留时间tR为14.88min，增幅较大，而且随炮制程度的增加而增幅增大。新产生成分两个，为色谱峰1和7，保留时间tR为6.23min和33.61min，其中色谱峰7增幅较大，而且随炮制程度增加增幅增大。各组色谱峰面积变化趋势见图2。

图1 雷公藤生药组和烘箱煨制组药物HPLC色谱

表2 各组药物对小鼠肝功能的影响 (±s,n=10)

注：与空白对照组比较，*P<0.05；与生药组比较，ΔP<0.05。

图2 烘箱煨制后色谱峰1～7峰面积变化趋势

4 讨论

雷公藤经黄泥包裹，150℃和200℃烘箱煨制后毒性比生药显著降低，而其治疗佐剂性关节炎效果显著提高，大大优于生药。研究发现雷公藤经烘箱煨制后，4个成分含量下降，1个成分含量增加，新产生成分2个，其中主要有效成分也是主要毒性成分的雷公藤甲素含量稍微下降。推测烘箱煨制对雷公藤的减毒增效作用可能与这些成分变化有关，值得进一步研究。本文首次报道了烘箱煨制雷公藤药效、毒性及成分变化情况。结果表明烘箱煨制对雷公藤具有确切的减毒增效作用，可大大提高雷公藤的临床应用安全性，值得推广应用。

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(责任编辑：尹晨茹)

2014-12-25