杜 磊，杜 杨，席菁聆

（1.安阳工学院 生物与食品工程学院，河南 安阳 455000；2.安阳市畜产品质量安全监测检验中心，河南 安阳 455000）

0 引言

随着人们健康意识的增加，保健食品日益被重视.目前，一直流行于日本人餐桌上的纳豆受到全世界人们的追捧.由纳豆制成的各种保健产品、生物制剂也很受人们欢迎.因此用于发酵纳豆及纳豆制品的纳豆芽孢杆菌制剂亦成为人们研究的热点.近年来，国内外食品科学研究者被纳豆菌极高的营养价值所吸引，研究并开发了大量的纳豆菌相关产品，其中以保存容易、食用方便为优点的纳豆菌冻干活菌制剂，市场销量最大，最受广大消费者欢迎.但在纳豆菌冻干活菌制剂的生产中，冷冻会对纳豆芽孢杆菌造成细胞损伤、机械损伤等一系列不良影响.直接冷冻纳豆芽孢杆菌菌液，会造成纳豆芽孢杆菌的大量死亡，而在菌液冷冻过程中，向菌液中加入适量保护剂可减少菌体细胞的死亡.因此提高纳豆芽孢杆菌冷冻存活率的关键在于有效保护剂的合理使用.近些年，有不少学者对相关方面进行了研究.Kilara[1]认为当冷冻前菌悬液浓度越大时，单个菌体细胞暴露在介质中的面积就越小，冷冻干燥菌种存活率就越大，此研究结果可以作为来选择菌液与保护剂混合的浓度配比的参考.宋金慧等[2]以酶解乳清培养基为离心基质，研究得出活菌存活率最高的离心条件为8 000 r/min、10 min；活菌冻干存活率最高的离心条件为4 000 r/min、10 min.胡仲秋等[3]以11%脱脂乳为液体培养基，以离心力、离心温度和离心时间为测定指标，结果表明：随着离心时间的增加，菌体离心损失率和离心存活率都减小；控制离心时间不变，增大离心力，离心损失率和离心存活率均降低，这些数据可以为离心条件提供参考.吴宝川等[4]以糖类、醇类、氨基酸类等冻干保护剂为研究对象，对其保护机制和作用对象进行了分析.常金梅等[5]认为控制菌种冻干过程存活率的影响因素有：菌种悬液的浓度、菌龄、培养基的成分、抗逆能力、冻结速度、复活处理、保护剂，优化以上因素中的1 种或几种，均有助于提高冻干菌种的存活率.上述研究结果可为本研究中保护剂的选择、配比、复活速度等提供参考.曹峰[6]、胥振国[7]、钟青萍等[8]都研究了纳豆菌冷冻保护剂复合配方.综合以上研究结果，作者选取比较成熟的保护剂如乳糖、甘露醇、麦芽糊精、L-抗坏血酸钠、β-环糊精等为研究对象，进行纳豆菌保护剂的研究.

1 材料与方法

1.1 材料

纳豆芽孢杆菌：北京川秀科技有限公司.

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2D 型净化工作台：苏州净化设备有限公司；5430R 台式超高速离心机：艾本德中国有限公司；LDZH-100KBS 立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；ZWY-1102C 恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；BCD-290W 医用冷藏箱：青岛海尔股份有限公司.

1.3 方法

1.3.1 纳豆菌培养基的制备

种子培养基的制备：参照GB 4789.28—2013[10].

发酵培养基的制备：分别称取蛋白胨30 g、葡萄糖45 g、MgSO43 g、K2HPO41.5 g、KH2PO43 g，加入1 500 mL 蒸馏水，配制成1 500 mL 发酵培养基，在高压蒸汽灭菌器中，121 ℃灭菌20 min 后备用.

1.3.2 纳豆菌菌种活化

在超净工作台内，取100 mL 种子培养基，置于250 mL 三角瓶中，取适量纳豆菌菌粉，接种于种子培养基，摇匀，将接种好的培养基置于150 r/min、40 ℃摇床培养24 h，得到种子液.重复2～3次.

1.3.3 纳豆菌扩大培养

按照3%接种量接种于每个三角瓶中，摇匀，将接种好的三角瓶置于180 r/min、40 ℃摇床培养24 h，这个时期正好是菌种的对数期.

1.3.4 纳豆菌的收集

将发酵液在4 ℃下，以5 000 r/min 离心10 min，在超净工作台中收集菌泥，将收集好的菌泥用无菌生理盐水稀释至一定浓度，将稀释好的菌悬液放在4 ℃冰箱保存备用.

1.3.5 冷冻保护剂单因素试验

取稀释备用的菌悬液，不加保护剂置于-20 ℃普通冰箱冷冻48 h，用稀释涂布平板法测定冷冻后活菌数，解冻条件为：40 ℃，2 h，得出纳豆菌存活率为13.30%（作为对照组）.

按表1 选取乳糖、甘露醇、麦芽糊精、L-抗坏血酸钠、β-环糊精5 种保护剂进行单因素试验.将保存备用的菌悬液置于37 ℃培养箱复苏培养1 h，取0.1 mL 复苏后的菌悬液稀释涂布平板计数，得到原始菌悬液中活菌浓度.取预先配制好的不同浓度保护剂与菌悬液，混合均匀，将混合液置于-20 ℃普通冰箱冷冻48 h，用稀释涂布平板法测定冷冻后活菌数，用冷冻后菌体存活率来反映各单一保护剂的保护效果.

表1 单一保护剂浓度Table 1 The quality of single protective agent concentration

1.3.6 纳豆菌存活率测定

采用稀释涂布平板法测定冷冻前后保护剂菌液混合液中纳豆菌活菌数，然后根据以下公式计算纳豆菌的存活率：纳豆菌存活率=（冷冻后每毫升菌悬液活菌数/冷冻前每毫升菌悬液活菌数）×100%.

1.3.7 冷冻保护剂的正交试验

根据单因素试验结果，采用四因素三水平L9（34）设计正交组合优化保护剂的配方.

2 结果与分析

2.1 5 种冷冻保护剂单独使用对纳豆菌冷冻存活率的影响

2.1.1 不同浓度乳糖对纳豆菌冷冻存活率的影响以不同浓度的乳糖为保护剂，配制保护剂菌液混合液，将混合液在-20 ℃冷冻后，测定混合液中纳豆菌的存活率，结果见图1.由图1 可知，乳糖对纳豆菌在冷冻过程中具有保护作用，0.4%的乳糖就能使纳豆菌的存活率较不加保护剂的对照组增大3.06 倍，随着乳糖浓度的增大，纳豆菌的存活率也明显提高，当乳糖浓度为1.2%时，纳豆菌的存活率达到76.72%，比不加保护剂的对照组提高60%以上.这可能是由于在冷冻过程中，乳糖通过“ 水置换作用”抑制菌体细胞膜磷脂脱水，阻止糖链间的范德华力增强，阻碍菌体细胞膜结构的变化，从而保护菌体不被损伤.

图1 不同浓度乳糖对纳豆菌冷冻存活率的影响Fig.1 Effect of different concentration of lactose on natto fungus frozen survival rate

2.1.2 不同浓度甘露醇对纳豆菌冷冻存活率的影响

以不同浓度的甘露醇为保护剂，配制保护剂菌液混合液，将混合液在-20 ℃冷冻后，测定混合液中纳豆菌的存活率，结果见图2.由图2 可知，甘露醇对纳豆菌在冷冻过程中也具有保护作用.甘露醇浓度为4%时，纳豆菌冷冻存活率达到67.44%，比不加保护剂的对照组增大50%以上.这是因为菌体处于低温环境时，适宜浓度的甘露醇能够在水中形成无定型结构，这种结构能够维持蛋白质的稳定，阻止细胞膜蛋白质分子的聚集，从而保护细胞膜骨架不被损坏.当甘露醇浓度低于或高于4%时，纳豆菌冷冻存活率都降低，这是因为甘露醇在此浓度时形成了结晶，促进了细胞膜蛋白质的聚集，不仅起不到保护细胞膜蛋白质结构稳定的作用，反而更有利于细胞膜骨架的损坏.通过对试验结果的分析，最终选取甘露醇浓度为4%进行正交试验.

图2 不同浓度甘露醇对纳豆菌冷冻存活率的影响Fig.2 Effect of different concentration of mannitol on natto fungus frozen survival rate

2.1.3 不同浓度麦芽糊精对纳豆菌冷冻存活率的影响

以不同浓度的麦芽糊精为保护剂，配制保护剂菌液混合液，将混合液在-20 ℃冷冻后，测定混合液中纳豆菌的存活率，结果见图3.由图3 可知，麦芽糊精对纳豆菌在冷冻过程中也有保护作用.当麦芽糊精的浓度为5%时，纳豆菌的存活率达到69.32%，比对照组提高50%以上.这可能是因为麦芽糊精本身是一种高分子多糖，菌液冷冻过程中适宜浓度的麦芽糊精可完全包裹菌体细胞，使菌体细胞不与外界氧气接触，由麦芽糊精形成的保护层保护细胞壁不被损坏，胞内物质不泄漏，从而提高菌液冷冻存活率.

2.1.4 不同浓度L-抗坏血酸钠对纳豆菌冷冻存活率的影响

图3 不同浓度麦芽糊精对纳豆菌冷冻存活率的影响Fig.3 Effect of different concentration of maltodextrin on natto fungus frozen survival rate

以不同浓度的L-抗坏血酸钠为保护剂，配制保护剂菌液混合液，将混合液在-20 ℃冷冻后，测定混合液中纳豆菌的存活率，结果见图4.由图4可知，L-抗坏血酸钠对纳豆菌在冷冻过程中具有很好的保护作用.L-抗坏血酸钠浓度为2%时，纳豆菌冷冻存活率高达74.34%，比不加保护剂的对照组增大60%以上.这是因为在冷冻过程中，L-抗坏血酸钠具有还原性，可以减少空气中的氧对菌体的破坏，同时L-抗坏血酸钠对菌体蛋白质也有一定的保护作用，可降低冷冻对菌体细胞膜造成的损伤，从而提高纳豆菌冷冻存活率.然而，随着L-抗坏血酸钠浓度的增加，纳豆菌冷冻存活率反而降低.这说明，在菌液冷冻过程中并不是保护剂的浓度越大保护效果越好，而是存在一个最佳浓度.

图4 不同浓度L-抗坏血酸钠对纳豆菌冷冻存活率的影响Fig.4 Effect of different concentration of L-ascorbic acid sodium on natto fungus frozen survival rate

2.1.5 不同浓度β-环状糊精对纳豆菌冷冻存活率的影响

以不同浓度的β-环状糊精为保护剂，配制保护剂菌液混合液，将混合液在-20 ℃冷冻后，测定混合液中纳豆菌的存活率，结果见图5.由图5 可知，以β-环状糊精为保护剂，虽然其对纳豆菌的冷冻有一定的保护作用，但是纳豆菌的最大存活率仅为20.41%，比不加保护剂的对照组只增大了7%.β-环状糊精和麦芽糊精类似，也是一种大分子多糖，然而其对菌体的保护作用远不及麦芽糊精，这可能与β-环状糊精的结构有关，同时其水溶性差也可能是一个重要的原因.

图5 不同浓度β-环状糊精对纳豆菌冷冻存活率的影响Fig.5 Effect of different concentration of βcyclodextrin on natto fungus frozen survival rate

2.2 冷冻保护剂正交组合优化试验

为进一步提高纳豆菌冷冻后的存活率，选择单因素中对纳豆菌存活率保护效果较好的4 种保护剂：乳糖、甘露醇、麦芽糊精、L-抗坏血酸钠进行正交试验，结果见表2.

从表2 可知，乳糖对菌体的存活率影响最大，麦芽糊精次之，L-抗坏血酸钠和甘露醇对菌体存活率影响较小，保护剂最优组合为A2B1C1D3.即：乳糖1.2%、甘露醇3%、麦芽糊精4.5%、L-抗坏血酸钠2.5%.而试验中得到的最优组合为A2B1C2D3，即乳糖1.2%、甘露醇3%、麦芽糊精5%、L-抗坏血酸钠2.5%.因此需做验证试验.

表2 L9（34）正交试验结果Table 3 Design and results of L9（34）orthogonal experiment

通过验证性试验最终确定的纳豆菌冷冻保护剂复合配方为：乳糖1.2%、甘露醇3%、麦芽糊精4.5%、L-抗坏血酸钠2.5%.此时冷冻后菌悬液中活菌存活率为84.25%，大于各单一因素菌体的存活率.说明单一保护剂对纳豆菌冷冻的保护作用较小，而保护剂复配后，相互间具有协同作用，从而大大提高冷冻过程中菌体存活率.

3 结论

通过单因素试验从5 种保护剂中筛选出纳豆菌的有效冷冻保护剂，其中对纳豆菌活菌存活率影响较大的因素为：乳糖、甘露醇、麦芽糊精、L-抗坏血酸钠，其中乳糖对菌体存活率影响最大.这可能是由于在冷冻过程中，菌体细胞膜磷脂脱水，细胞膜中磷脂分子间，分子极性增强，细胞膜糖链间的范德华力增强，菌体细胞膜结构发生相变，而乳糖作为冷冻保护剂可以通过“ 水置换作用”抑制细胞膜的相变，保护菌体.纵观保护剂对纳豆菌冷冻存活率的影响趋势，随着保护剂浓度的增加，菌体的存活率不断提高，但达到一定浓度时，保护剂的效果达到最大值，此后再增加保护剂浓度保护效果反而降低.这说明菌粉冷冻保护剂的浓度不是越大越好，而是存在一个最佳浓度.

在冷冻保护剂的选择上，未选用目前大多数学者所青睐的保护剂——脱脂乳粉.原因在于，尽管脱脂乳粉在纳豆菌冷冻过程中保护效果明显，但在纳豆菌冻干菌粉的生产制备过程中，菌液冷冻后需要进行干燥，菌液中所添加的保护剂干物质含量越高，干燥后所得菌粉中纳豆菌的含量就相对越低.以脱脂乳粉作为保护剂，其最佳添加量在15%左右，干燥后的菌粉中干物质含量较高，这样就大大降低了纳豆菌冻干菌粉中活菌含量，从而大大降低了纳豆菌冻干制剂的生产效率.

［1］Kilara A，Shahani，K M，Das N K.Effect of cryoprote ctiveagents on freeze drying and strorage of lactic culture Cult［J］.Dairy Prod，1976，11:8-11.

［2］宋金慧，吕加平，王非，等.离心条件对冻干菌株存活率影响的研究［J］.食品工业科技，2009，30（11）:82-84.

［3］胡仲秋，李志成，蒋爱民，等.离心条件对乳酸菌存活率的影响［J］.食品研究与开发，2010，31（2）:7-9.

［4］吴宝川，李敏.冷冻干燥保护剂在改善冻干食品品质的应用进展［J］.中国食品添加剂，2012（6）:219-224.

［5］常金梅，蔡芷荷，吴清平，等.菌种冷冻干燥保藏的影响因素［J］.微生物学通报，2008，35（6）:959-962.

［6］曹峰，董贝磊，陆晓滨，等.保护剂及冷休克处理对纳豆菌冻干后存活率的影响［J］.食品工业科技，2008，29（2）:123-128.

［7］胥振国，蔡玉华，向敏，等.冻干高活力纳豆芽孢杆菌菌粉保护剂的筛选和优化［J］.微生物学通报，2013，40（5）:822-828.

［8］钟青萍，王发样，刘家畅，等.纳豆菌活菌干燥剂的研制［J］.食品工业科技，2005，26（8）:78-81.

［9］GB 4789.28—2013，食品微生物检验培养基和试剂的质量要求［S］.