周雅丹，张国治，范 璐

（河南工业大学1.粮油食品学院；2.分析测试中心，河南 郑州 450001）

0 引言

胰酶是从动物胰脏中提取的一种混合酶制剂，含有胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶3 种主要消化酶和其他生物活性物质.胰酶在食品工业、皮革工业、医药工业，以及科研等领域都有广泛的用途.在食品加工业中应用胰酶生产氨基酸以及干酪素等；皮革工业中应用胰酶脱脂、软化，不仅能提高产品质量和等级，而且可以节约成本；在医药上可以作为助消化药物，用于治疗消化不良，食欲不振，慢性胰腺炎等疾病；在科研领域，胰酶主要应用于细胞培养技术研究等[1-5].生产胰酶的方法有碱溶液提取法、酸溶液提取法、盐溶液提取法、水洗提取法、有机溶剂提取法和超声波辅助碱提法等，目前国内从猪胰脏中提取胰酶的报道有很多[6-8]，且大都使用有机溶剂提取方法.作者以鸡胰脏为原料，采用有机溶剂提取法，通过单因素试验研究提取胰酶条件的pH、温度、时间，以及提取溶剂异丙醇浓度对胰酶活力及相关品质的影响，并通过正交试验确定鸡胰酶制备最佳工艺条件.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡胰脏购于郑州菜市场；氯化钙、三氯醋酸、阿拉伯胶粉：天津市科密欧化学试剂有限公司；麦芽糖、马铃薯淀粉、牛胆盐：北京奥博星生物技术有限责任公司；氢氧化钠、硫代硫酸钠：北京化工厂；硼酸：北京朝阳区金盏化工厂；异丙醇：天津市天力化学试剂有限公司；丙酮：洛阳市化学试剂厂.所有试剂均为分析纯.

1.2 主要仪器与设备

pHB-5 便携式pH 计：上海伟业仪器厂；UV-2600 紫外分光光度计、AY-120 电子分析天平：日本岛津；J-26XP 台式高速冷冻离心机：美国贝克曼库尔特；HHS 型电热恒温水浴锅：金坛市华峰仪器有限公司；LGJ-18C 冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂；冰箱：青岛海尔股份有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

新鲜/冷冻鸡胰脏→胰浆→激活提取→过滤→胰乳滤液→高浓度异丙醇沉淀→离心→脱脂→冷冻真空干燥→胰酶粉.

1.3.2 单因素试验设计

胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶活力、脂肪残留和干燥失重为胰酶鉴定指标，在工业化生产中胰酶提取率也是重要考察指标.在制备过程中，沉淀剂异丙醇浓度60%、沉淀温度4 ℃、脱脂剂为预冷丙酮不变，通过改变提取激活条件的pH、温度、提取剂浓度和时间，分别做3 次重复试验，考察这些因素对鸡胰酶活力、提取率和其他品质指标的影响.

1.3.3 正交试验设计

根据单因素试验结果，在提取激活pH、温度、提取剂浓度和时间4 个因素中，每个因素选择三水平，选用正交表L9（34）进行试验，从中选出最佳水平组合.

1.3.4 胰酶活力测定及相关品质测定的方法

胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶活力及相关品质（脂肪残留、干燥失重）的测定参照《中华人民共和国药典》[9].

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 提取激活pH 值对胰酶活力的影响

考察提取激活pH 为4、5、6、7、8 对胰酶活性的影响，其他工艺参数为：提取剂浓度为10%、激活时间为6 h、提取激活温度为5 ℃、保护剂为麦芽糖0.5%，马铃薯淀粉0.5%、激活剂为氯化钙0.2%、沉淀剂浓度为60%，在不同pH 条件下制备胰酶，试验重复3 次，取平均值，胰酶活力及其他品质指标结果见表1，pH 为6 时，三酶活力及提取率均最高，因此单从pH 来考虑，pH 在5～7 之间，酶活力较高.

表1 不同提取激活pH值对胰酶的三酶活力、提取率及其他品质的影响Table 1 Effects of different pH value of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.1.2 提取激活温度对胰酶活力的影响

其他提取条件不变，提取激活温度设定为5℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃，试验重复3 次，取平均值，胰酶活力及其他指标结果见表2.温度过高，导致胰酶失活，当温度高于或低于15 ℃，三酶活力及质量收率都降低，温度在（15±5）℃范围内，胰酶活力和提取率较高.

表2 不同提取激活温度对胰酶的三酶活力、提取率及其他品质的影响Table 2 Effects of different temperature of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.1.3 提取剂浓度对胰酶活力的影响

其他提取条件不变，提取剂浓度设为5%、10%、15%、20%、25%，试验重复3 次，取平均值，胰酶活力及其他指标结果见表3.随着异丙醇浓度增加，三酶活力均是先增加后降低，要保证较高的酶活力和提取率，同时节省异丙醇用量，激活提取过程中应选择提取剂浓度在5%～10%之间.

表3 不同提取剂浓度对胰酶的三酶活力、提取率及其他品质的影响Table 3 Effects of isopropyl alcohol concentration of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.1.4 提取激活时间对胰酶活力的影响

考察激活提取时间为2、4、6、8、10 h 对提取效果的影响，试验重复3 次，取平均值，结果见表4.提取激活时间为6 h 时，三酶活力达到最高.时间过短，胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶未被完全溶出，活力较低；时间过长，酶自身降解，酶活力降低.随着提取时间延长，三酶活力均是先增加后降低，要保证较高的酶活力和提取率，激活提取时间选择在5～7 h 之间.

表4 不同提取激活时间对胰酶的三酶活力、提取率及其他品质的影响Table 4 Effects of different time of extracting and activating on the three enzyme activity，yield and other indicators of pancreatin

2.2 正交试验结果与分析（表5—表8）

根据单因素试验结果确定激活提取pH 5～7，温度（15±5）℃，提取剂浓度5%～10%，时间5～7 h，通过L9（34）正交试验确定提取鸡胰酶最佳工艺参数.从表7 可确定最优组合为A3B1C2D1，由表8可知，胰酶制备在该工艺条件下是可行的，胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力均符合国家药典标准（胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力分别为4 000 U/g、7 000 U/g、600 U/g，脂肪残留量为20 mg·g-1，干燥失重5%）.

表5 L9（34）正交试验因素与水平Table 5 The factors levels of orthogonal test L9（34）

表6 正交试验L9（34）结果Table 6 The results of the orthogonal test L9（34）

表7 正交试验的直观分析结果Table 7 The visual analysis results of the orthogonal test L9（34）

表8 验证试验所得到胰酶的三酶活力、提取率和其他指标Table 8 The three enzyme activity,yield and other indicators of pancreatin of verification experiments

3 结论

通过对鸡胰脏中提取胰酶的工艺条件的探讨，确定最佳优化工艺条件为：以新鲜或冷冻鸡胰脏为原料，使用浓度为7.5%异丙醇为提取剂（原料量的1.5 倍），同时加入激活剂（氯化钙0.2%），保护剂（麦芽糖0.5%，马铃薯淀粉0.5%），在温度为(10±1) ℃，pH 为7 条件下提取激活5 h 后过滤，将预冷至4 ℃99.7%的异丙醇加入滤液中，使异丙醇浓度达到60%，冷冻离心沉淀，用预冷丙酮进行脱脂，冷冻真空干燥，粉碎得到胰酶粉.在该工艺条件下制备的胰酶中胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力分别为13 830 U/g、11 600 U/g、1 596 U/g，提取率为9.2%，脂肪残留量为18.99 mg·g-1，干燥失重3.86%，均符合国家药典标准（胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶活力、脂肪残留量、干燥失重分别为4 000 U/g、7 000 U/g、600 U/g、20 mg·g-1、5%）.

［1］吴晓英，张聚宝，林影，等.胰酶制备新工艺的研究［J］.广东药学院学报，2005，21（1）:64-67.

［2］Andriamihaja M，Guillot A，Svendsen A，et al.Comparative efficiency of microbial enzyme preparations versus pancreatin for in vitro alimentary protein digestion ［J］.Amino Acid，2013，44（2）:563-572.

［3］Nakamura T，Tandoh Y，Terada A，et al.Effects of high-lipase pancreatin on fecal fat，neutral sterol，bile acid，and short-chain fatty acid excretion in patients with pancreatic insufficiency resulting from chronic pancreatitis［J］.International Journal of Pancreatology，1998，23（1）:63-70.

［4］赵小兰.胰酶制备工艺研究［J］.青海医药杂志，2000，30（4）:56-57.

［5］郭兆斌，韩玲，刘亮亮，等.猪胰脏中胰酶的提取工艺优化研究［J］.食品科学，2009，30（22）:162-164.

［6］王伟林，郑树森.慢性胰腺炎的胰酶替代治疗［J］.中国实用外科杂志，2011，31（9）:823-825.

［7］魏文毅，张丽萍，王琴，等.猪胰脏中胰酶的制备新工艺技术研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2011，23（1）:72-78.

［8］安正仑，高学军，孙福忠.猪胰酶制备工艺研究［J］.黑龙江畜牧兽医，2006（11）:74-75.

［9］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典:二部［S］.北京:化学工业出版社，2005:625-627.