金慧鸣，谭兴和，*，蔡文，郭红英，王锋，张喻，邓洁红（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

茅岩莓黄酮提取分离纯化技术的研究进展

金慧鸣1，2，谭兴和1，2，*，蔡文1，2，郭红英1，2，王锋1，2，张喻1，2，邓洁红1，2
（1.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南长沙410128）

摘要：对茅岩莓总黄酮和二氢杨梅素提取的提取、分离和纯化方法的研究现状进行了综述，以期为茅岩莓黄酮的进一步研究提供参考。

关键词：茅岩莓；黄酮；提取；分离；纯化

茅岩莓，又名藤茶、白茶、甘露茶等，学名显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），属葡萄科，蛇葡萄属，是一种野生藤本植物[1]。它主要分布于长江以南的广东、广西、云南、贵州、湖南、湖北、江西、福建等地区[2]。茅岩莓具有清热解毒、祛风湿、强筋骨等药用功效，将其嫩茎叶制成茶可用于治疗感冒发热、咽喉肿痛、黄疸型肝炎、疤疖等症[3]。研究表明，茅岩莓富含黄酮类化合物等生理活性成分，其黄酮类成分中二氢杨梅素含量最高[4]。二氢杨梅素（Dihydromyricetin，简称DMY），又称双氢杨梅素，在茅岩莓的嫩茎叶中的含量可达30%，甚至更高[5]。它具有抗氧化、抑菌、调节免疫力、降血脂、清除自由基、抗血栓、抗肿瘤、消炎、抑制前列腺癌细胞和肝癌细胞生长等重要生理保健功能[6-9]。目前，茅岩莓这一药食同源性食物的开发尚处于初级阶段，其黄酮等天然活性成分在医药、食品添加剂和保健品等领域有着广阔的应用前景，如何最大限度的提高茅岩莓黄酮的提取得率，并有效利用茅岩莓黄酮，是非常值得研究的问题。本文对茅岩莓总黄酮和二氢杨梅素的提取分离纯化方法进行了综述，以期为该黄酮和二氢杨梅素的深入研究和实践应用提供理论参考。

1　茅岩莓黄酮提取方法

1.1热水提取法

热水提取法是一种较传统的提取方法，因黄酮在热水中溶解度比较大，可采用热水浸提或者煮提。例如Xia H等[10]采用热水提取法提取二氢杨梅素并通过单因素试验和正交试验分析得出最佳提取条件为：提取温度90℃，料液比1∶10（g/mL），提取时间1 h，此条件下得率最大为18.2%。熊璞等[11]采用了热水提取法，对比研究了提取级数对提取率的影响，结果发现二级提取的提取率明显高于一次提取的提取率，而在二级提取的级数上再进行增加，则提取率趋于平稳，该学者通过正交试验优化了二级提取工艺，在最优提取条件下二氢杨梅素的提取率能达到30.81%。水提法具有提取过程简单，成本低，不易造成污染等优点。但是因为热水提取法只能提取黄酮苷类物质，不能提取黄酮类、黄酮醇类、黄酮醇苷类等化合物，而且对温度要求相对较高，提取效率相对较低，且提取后浓缩比较困难，所以热水提取法不适合实际生产过程中的应用[12]。

1.2乙醇提取法

黄酮类化合物极性较强，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。但由于甲醇、丙酮成本高，毒性较大，而乙醇毒性小，经济环保易回收，所以一般用乙醇作为提取剂。陈玉琼等[13]研究发现当乙醇浓度为67%时，黄酮浸出率最高，继续提高乙醇浓度，茅岩莓黄酮的浸出量反而下降；提取温度应控制在80℃以下，否则，黄酮的提取率也会下降。胡立志等[14]通过响应面试验优化得到了最适提取工艺条件：提取温度70℃，加热时间1 h，乙醇浓度58%，固液比为1∶40（g/mL），在此条件下总类黄酮提取率可达到73.93%。

1.3超临界流体萃取法

超临界萃取是一种以超临界流体作为萃取剂，在临界温度和临界压力附近的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离组分的技术。常用的超临界流体有CO2、SO2、C2H4、C2H6、C3H8等，其中以CO2最为常用，因为其临界条件易达到，无毒、无味、不燃、价廉、易精制。超临界流体萃取法作为一种新兴的提取技术，在茅岩莓黄酮的提取研究中较为少见。Wang Y等[15]探讨了超临界萃取过程中各因素对提取物得率和纯度的影响，通过正交实验确定提取二氢杨梅素的最优条件为萃取压力250 bar，萃取温度40℃，萃取时间50 min，夹带剂是体积比为1∶3的甲醇/乙醇溶液，此条件下每克干物质萃取的总黄酮量为4.67 mg（以芦丁计）。Ying L 等[16]则通过正交实验得到的最优条件为压力500 bar，温度50℃，时间为80 min，夹带剂为95%的乙醇，此条件下能从每克干物质中萃取出5.99 mg（以芦丁计）总黄酮。夹带剂的添加能够显著提高溶质在超临界CO2中的溶解度和萃取率，但如果夹带剂的种类和数量选择不合适则会造成提取率低的结果。与常规萃取方法相比，采用超临界萃取技术提取黄酮，不但提取时间短，萃取率高，而且还具有提取条件温和、物质活性成分不易被破坏、无溶剂残留、无污染、萃取分离一步完成等优点，特别适合应用到食品和药品中，缺点是设备投资较大。

1.4超声波辅助提取法

超声波是频率高于20 000 Hz的声波，在介质中传播可产生强烈的机械振动、热能和空化现象。因此超声波能够加强了植物细胞内物质的释放、扩散及溶解，具有时间短，效率高且提取率高等优点。陈帅等[17]用30倍量体积分数为70%乙醇浸泡茅岩莓粗粉30 min后超声提取黄酮3次，每次20 min，最后总黄酮得率为35.86%。陈文生等[18]将样品用甲醇溶解后直接超声提取进样检测，避免回流提取法时长且效率低的缺点，使得实验前处理操作更加简单，测定结果更加准确。目前，超声波在植物有效成分的提取中显现了明显的优势，但超声波功率过大时也可能存在降低有效成分活性的缺点。

1.5微波辅助提取法

微波是一种利用被加热物体本身作为发热体而进行的加热方式，同时直接加热物体的内部和外部，所以具有加热速度快，均匀性好等优点，可避免原料中的有效成分受长时间高温作用而影响其品质，可提高提取物品质和得率。Li W等[19]通过比较微波辅助循环阶段连续逆流提取和微波辅助间歇提取二氢杨梅素的效果，发现在相同条件下，前者的得率能达到92.31%，而后者只有74.05%。倪峰等[20]采用微波辅助半仿生提取工艺提取茅岩莓中的有效成分，建立了一种高效环保快捷的新提取方法，降低了长时间加热处理过程中有效成分的破坏程度。Li H等[21]将微波辅助提取与回流提取、超声波辅助提取进行比较，发现微波辅助提取法提取茅岩莓中的二氢杨梅素的提取率最高且用时最短，该方法适合大规模快速提取二氢杨梅素。

1.6酶提取法

植物中的黄酮类化合物主要存在于细胞壁中，在提取过程中适当的利用酶处理，可使植物组织细胞壁发生软化膨胀等改变，从而改变细胞的通透性，有利于黄酮类化合物最大限度的溶解出来，大大提高黄酮的提取率[22]。最常使用的酶有纤维素酶、果胶酶等。酶提取法是一种安全无毒的生物提取技术，具有廉价环保、反应条件温和、不改变提取物结构和性质、提取率高等优点。作为一种新兴提取技术，在近年来的黄酮提取研究中得到了越来越多的应用，但是在茅岩莓黄酮的研究中尚未有报道，可以在提取方法上做进一步尝试与研究。

2　黄酮类化合物的分离纯化方法

2.1重结晶法

利用二氢杨梅素在不同水温下溶解度的差别，可用热水溶解，冷水结晶，使其纯度不断提高。Gao J等[23]通过5次重结晶从41.87 g二氢杨梅素粗提物中得到3.9 g纯度在95%左右的二氢杨梅素。这种方法工艺较简单，操作相对方便，但由于水溶性杂质去杂速度慢且难以去除，因此可运用重结晶与其他溶剂应用相结合的办法进行纯化。例如易海燕[24]用水溶解粗二氢杨梅素，用石油醚萃取进行重结晶，粗提物经3次结晶后二氢杨梅素的纯度由45.62%提高到86.72%，而纯度为45.62%的总黄酮粗提物经3次结晶后纯度达到92.32%，但最后成品中可能有少量石油醚存在，影响了产品的安全性和应用范围。

2.2大孔树脂吸附法

大孔树脂是一种非极性或略亲水高分子聚合物，有很强的吸附能力，可获得被吸附的分子[25]。陈玉琼等[26]研究发现1号树脂吸附和解吸附效果较好，但对茅岩莓黄酮的纯化只能达到70%左右，黄酮要达到更高的纯度还需依赖其他的纯化手段。孔庆童等[27]优化筛选大孔树脂纯化茅岩莓黄酮的最佳工艺条件，发现HPD100树脂的吸附效果最好，在最佳条件下，吸附率可达85.44%，洗脱率为94.92%，回收率为95.66%，黄酮质量分数可从2.76%纯化至81.1%。该方法具有易操作，易再生，成本相对低廉，效果好，回收率高等优点，在黄酮等成分的分离纯化领域中得到了广泛的应用。

2.3柱色谱法

柱色谱法是从植物粗提物中分离黄酮类化合物最有效的方法之一。它的填料吸附剂有聚酰胺、硅胶、葡聚糖凝胶、纤维素等。柱色谱具有使用范围广、寿命长、容量大、分离效果好、操作简单等特点。硅胶是柱色谱中一种传统的吸附剂，因与黄酮类化合物有较强的吸附能力，所以很难洗脱。它主要用于分离极性较低的黄酮类化合物如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮醇和高度甲基化或乙基化的黄酮和黄酮醇[28]。周天达等[29]直接将乙醇回流提取得到的54 g粗品上硅胶层析柱，用甲苯-乙酸乙酯-甲醇（10∶8∶5）洗脱，得到380 mg二氢杨梅素结晶。聚酰胺是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，具有较大的吸附容量。对黄酮类化合物来说，分离效果好，样品容量大，但洗脱速度慢，死吸附较大[30]。姜仕先等[31]采用200目～400目聚酰胺柱层析，以乙醇-水梯度洗脱，在24.4 g总黄酮中能够得到18.3 g的二氢杨梅素。

2.4高速逆流色谱法

高速逆流色谱法（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱分离技术，具有连续有效的分配功能。因为该方法不使用固相载体作为固定相，所以HSCCC避免了固相载体带来的样品预处理要求高、因不可逆吸附而引起的样品损失、失活变性等问题[32-33]。与常规方法相比，该法快速简便，低风险，产物纯度较高，分离重现性好，在分离提纯领域中的应用越来越多。Du Q 等[34]采用三联柱高速逆流色谱和正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水溶液体系（1∶3∶2∶4，体积比）纯化16 g从茅岩莓叶子中提取的二氢杨梅素，得到11.3 g纯度达到99%以上的二氢杨梅素。张友胜等[35]使用GS10AAKTAprime plus高速逆流色谱联用设备，将粗茅岩莓样品同时分离得到纯度大于99%的二氢杨梅素和杨梅素，分离得率分别为85.5%和87.6%。使用高速逆流色谱法分离纯化可以一次性获得高纯度样品，但难以一次性获得大量样品。因此在应用于化学成分的分离提纯时，可以用HSCCC法与其它分离方法互补进行。

3　展望

目前，多种传统方法在茅岩莓黄酮类化合物的提取和分离纯化应用中已较为成熟，超临界萃取等高新技术也逐渐深入，但茅岩莓黄酮的酶提取法还尚未有相关研究。因此，需进一步尝试并完善茅岩莓黄酮类化合物的提取方法和分离纯化方法，最大限度提高其提取率和经济效率，有助于实现茅岩莓及其副产品深度开发和产业化生产。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.047

收稿日期：2014-07-14

基金项目：国家自然科学基金项目（31371817）；湖南省自然科学基金项目（2015JJ3076）

作者简介：金慧鸣（1990—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：农产品加工。

*通信作者：谭兴和（1959—），男，教授，长期从事农产品加工研究。

Research Progress in Extraction，Separation and Purification of Flavonoids from Ampelopsis Grossedentata

JIN Hui-ming1，2，TAN Xing-he1，2，*，CAI Wen1，2，GUO Hong-ying1，2，WANG Feng1，2，ZHANG Yu1，2，DENG Jie-hong1，2
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，Hunan，China；2.Key Laboratory for Food Science and Bio-Technology of Hunan Province，Changsha 410128，Hunan，China）

Abstract：This paper introduced the extraction techniques of total flavones and dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata，and introduced the separation and purification technique，expected to provide reference for the further research of flavonoids from Ampelopsis grossedentata.

Key words：ampelopsis grossedentata；flavonoids；extraction；separation；purification