赵娜，程金芝（白城师范学院，吉林白城137000）

籽粒苋营养面包酵母菌的分离与鉴定

赵娜，程金芝*
（白城师范学院，吉林白城137000）

摘要：从自然发酵的籽粒苋营养面包的生面团中分离得到一株具有潜在应用价值的产香味酵母菌Y-21菌株。通过常规的形态和生理生化特性以及ITS rDNA鉴定为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum），并对其菌株进行发酵性能测试。结果表明Y-21菌株的最适发酵温度为30℃，pH为5.5，在籽粒苋杂粮面包发酵与烘焙应用的初步研究中，面团发酵效果良好，可以充分发挥籽粒苋面包的独特风味，具有潜在的应用价值。

关键词：籽粒苋；面包酵母菌；分离；鉴定

籽粒苋属于苋科（Amaranthceae），苋属（Amaranthus）一年生草本植物，具有广泛适应性[1]。本文所采用的籽粒苋为粒用苋，是1991年中国农科院从美国引进的R104品种，该品种特性籽粒多、高产而质优[2]。籽粒苋营养丰富，富含蛋白质，氨基酸组成合理，其中富含赖氨酸、精氨酸等谷类作物的限制性氨基酸，脂类以不饱和脂肪酸为主，含有角鲨烯，同时还富含钙、镁、铁等矿物质元素[3-5]。籽粒苋籽实在国外被称作健康食品，被作为食物使用，如籽粒苋饼干、面条、披萨、面包等烘焙食品[6-8]。由于“三高人群”的日益增多，人们越来越注重饮食健康，籽粒苋由于丰富的营养在国内也备受关注[9-10]。譬如：湖北农科院研制的籽粒苋降糖粉[11]，白城师范学院程金芝教授研究的籽粒苋酸乳[12-13]和面包小试产品均在研制开发中。但在实验室研制开发的籽粒苋面包是利用商业活性干酵母酿制，香气单薄，典型性不突出。为此，针对籽粒苋富纤维营养面包，筛选适合的专用酵母菌菌种[14-17]，在发酵与烘焙应用研究中可以充分发挥籽粒苋的独特风味意义重大，同时也为籽粒苋食品产业化开发提供理论研究参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

籽粒苋品种R104：白城师范学院程金芝教授提供。

pMD18-T Vector：宝生物工程有限公司；引物合成及测序公司：华大基因；DNA片段凝胶回收试剂盒、小提质粒试剂盒：OMEGA公司；酵母浸膏、蛋白胨（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HK-35A烤箱：广州旭郎机械设备公司；HZQ-F16A型恒温电热培养箱：上海一恒科技有限公司；HZQF160全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；PC-818A型PCR仪：日本ASTEC；DYCP-31C琼脂糖水平电泳仪：北京六一；型凝胶成像系统：美国伯乐；UV-2800紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1籽粒苋自然发酵面团的制作

取一定量成熟饱满籽粒苋种子，水淘除杂并烘干。然后将淘净烘干的籽粒苋与水按料液比1∶10（g/mL）的比例榨成浆，之后用纱布过滤，所得的籽粒苋籽实置于烘箱中烘干，然后粉碎机制成籽粒苋籽实纤维粉。将称量好的籽粒苋粉和配料按一定比例放入面盆中，加水慢速搅拌，使配料充分溶解混合，直至揉成软硬适宜的面团。之后进行一次、二次醒发，并进行烘烤，最后对面包进行感官评价。

1.3.2酵母菌的分离和纯化

将自然发酵生面团用28℃温水稀释形成乳浊液，过滤，将含有酵母菌的滤液用PDA液体培养基进行初步培养。将所培养混合菌液在PDA固体培养基上进行划线培养，选取形态不同的单菌落，进一步划线分离，美兰染色，镜检，直至菌株为单一形态菌。最终将分离得到的酵母菌分离物进行编号，并保存于终浓度20%的甘油中或者接种斜面培养基保存。

1.3.3菌株的初步鉴定

1.3.3.1菌株形态学观察

观察复筛得到的性状优良菌株的菌落形态，同时在光学显微镜下镜检细胞形态。

1.3.3.2菌株的生理生化特性鉴定

菌株的生理生化特性鉴定参照《酵母菌的特征与鉴定手册》一书中的方法进行操作[18]。

1.3.4菌株分子生物学鉴定序列分析与系统发育树构建

参照邢福国2007年报道《酵母基因组的提取》文献[19]中利用溶菌酶破壁的方法进行酵母菌菌株基因组DNA的提取。采用真菌ITS rDNA通用引物对ITS1 和 ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行分子生物学鉴定。50 μL PCR反应体系为：2 μL模板、1 μL正反引物、1 μL（10 mol/L）dNTP、5 μL 10×PCR buffer （MgCl2）、1 μL E×TaqDNA聚合酶，无菌纯水补齐到50 μL。反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸10 min。反应产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用OMEGA回收试剂盒进行PCR产物回收，并将回收DNA片段连接到pMD18-T载体上，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于氨苄抗性的LB培养基平皿上，挑选阳性克隆进行测序。将测序结果提交至GenBank并获得接受号，使用BLAST程序与数据库中已有序列进行相似性比较分析，分析该菌株的分类地位。

1.3.5筛选酵母发酵特性研究

1.3.5.1Y-21菌株的最适温度值测定

接种菌株至PDA液体培养基中，28℃培养过夜。调节菌液浓度，以接种量为最初浓度100 cfu/μL，分别在不同的发酵温度（22、24、26、28、30、32、34、36、38、40℃）培养酵母，pH自然条件下发酵30 h，分别取样2 mL，用可见分光光度计在600 nm波长处测其吸光度。

1.3.5.2Y-21菌株的最适pH测定

接种菌株至PDA液体培养基中，30℃培养过夜。调节菌液浓度，以接种量为最初浓度100 cfu/μL分别接种初始pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0液体培养基中，30℃、120 r/min振荡培养，培养14h取样2mL，测定600 nm波长处吸光度。

1.3.5.3Y-21菌株生长曲线的测定

将菌株用PDA液体培养基培养14 h后，将菌液（调节菌液浓度100 cfu/μL）接种到灭菌的PDA液体培养基中，30℃恒温摇床培养，观察30 h菌株的生产情况，前期间隔2 h取样，用可见分光光度计在600 nm波长处测其吸光度，绘制出Y-21菌株生长曲线的变化趋势。

2　结果与分析

2.1籽粒苋面包的感官评价

籽粒苋面包感官质量评定[20]在面包冷却回软，未老化前进行，感官质量评定结果见表1。

2.2酵母菌的初步鉴定

2.2.1酵母菌Y-21菌株的形态特征观察结果

将Y-21菌株接种于PDA培养基上，于28℃培养2d，酵母菌Y-21菌株的形态特征观察结果如图1所示。

菌落形态如图1（a）所示，均为圆形，乳白色，质地均匀，边缘整齐，表面光滑、湿润、黏稠，易挑取，并散发淡淡的酒香味道。光学显微镜下镜检，如图1（b）所示，可见圆形或椭圆形细胞，大小为（4.0～5.0）μm×（4.5～8.7）μm，为一端出芽生殖。

2.2.2酵母菌的生理生化特性鉴定结果

酵母菌的生理生化特性鉴定结果如表2所示。

由表2结果所示，参照《酵母菌的特征与鉴定手册》检索表可知，碳源中葡萄糖能被菌株Y-21同化；麦芽糖、乳糖、D-甘露醇、乳酸和可溶性淀粉均不能被同化。氮源中硝酸钾和肌酸均不能被该菌株同化；尸胺和赖氨酸能被该菌株同化。并且，菌株在30℃培养试验中生长良好，由此可以看出 Y-21菌株与Hanseniaspora属的Hanseniaspora uvarum的特征极为相似。

2.3菌株的ITS通用引物的分子生物学鉴定结果及进化分析

以溶菌酶破壁法提取菌株的基因组DNA，以通用引物ITS rDNA扩增酵母菌整个ITS区域，扩增出的片段长度大约为750 bp，结果如图2所示。

将PCR扩增片段连接pMD18-T，将阳性质粒送华大基因进行测序，将测序得到的结果在NCBI数据库中进行同源序列搜索，得到与其亲缘关系相近的已知酵母菌的相关信息，并采用MEGA 5.0软件，利用邻接法构建进化树，结果如图3所示。

由图3可知，Y-21菌株与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度非常高，结合形态学的特征，可得知Y-21菌株为的葡萄汁有孢汉逊酵母不同菌种。

2.4Y-21菌株特性研究

2.4.1温度对Y-21菌株生长的影响

Y-21在不同温度的PDA培养基中的生长曲线如图4。

由图4可知，Y-21菌株在温度为30℃进行培养14 h后，菌量OD值可以达到最大值，并且可以达到相对稳定的状态。

2.4.2pH对Y-21菌株生长的影响

Y-21在不同pH的PDA培养基中的生长曲线如图5所示。

由图5可知，当pH≤4时，酵母菌的生长相对较为缓慢；而当pH≥4.5时，酵母菌的吸光值明显增长；当pH=5.5时，菌株OD值达到最大值，说明酸度对Y-21菌株的生长有一定的影响，该菌株的最适pH为5.5。

2.4.3Y-21菌株生长曲线的测定

Y-21在PDA培养基中的生长曲线如图6所示。

综上图4、5、6可知，Y-21菌株最适培养温度是30℃，最适pH为5.5，且在培养8 h左右开始进入对数生长期，培养至12 h～14 h时，OD值达到最大。

3　结论

通过对自然发酵的籽粒苋富纤维面包中酵母菌的定向分离、初筛、复筛以及生理生化的鉴定，获得一株具有优良产香能力的酵母菌菌株Y-21。通过分子生物学鉴定，该菌株ITS rDNA片段总长为747 bp，将测得的序列提交到NCBI数据库，并利用邻接法构建该菌株的进化树表明，Y-21菌株与葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）相似度非常高，结合形态学的特征，最终鉴定Y-21菌株为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）。本研究侧重于适合于籽粒苋面包发酵的菌株的筛选与鉴定，以更能发酵籽粒苋的独特味道，开发籽粒苋富纤维营养面包。有关该菌株对籽粒苋富纤维面包的发酵特性，还有待进一步的试验研究。日报,2014-06-05(15)

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.044

收稿日期：2015-10-26

基金项目：白城师范学院青年基金项目（2014C30号）

作者简介：赵娜（1985—），女（汉），讲师，博士在读研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。

*通信作者

Screening and Identification of Yeast for Production of Bread from Grain Amaranth

ZHAO Na，CHENG Jin-zhi*
（Baicheng Normal University，Baicheng 137000，Jilin，China）

Abstract：A aroma-producing yeast of strain named as strain Y-21 was screened from sourdough of Grain amaranth Bread by spontaneous fermentation.Morphological characteristics，physiological and biochemical tests and ITS rDNA sequence analysis revealed that it belonged to the species Hanseniaspora uvarum.In addition，the properties of strains Y-21 were also studied.The results showed that the optimal pH were 5.5. Preliminary studies on bread fermentation using Y-21strain indicated that bread products showed good and unique aroma，This aroma-producing yeast will have potential applications in baked products.

Key words：grain amaranth；baker's yeast；isolation；identification