胡鹏，张雅芬，崔海峰，俞晓平，叶子弘

（中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，杭州，310018）

菰黑粉菌转录调节因子Rbf1的克隆及表达分析

胡鹏，张雅芬，崔海峰，俞晓平，叶子弘

（中国计量学院生命科学学院/浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室，杭州，310018）

为研究菰黑粉菌的形态转换机制及灰茭形成机理，利用菰黑粉菌的转录组数据，分别从正常茭白中的菰黑粉菌（MT型）和灰茭中的菰黑粉菌（T型）中扩增得到Rbf1基因及开放阅读框序列。结果表明，2种菰黑粉菌的Rbf1基因序列相同，开放阅读框全长为1 281 bp，无内含子，NCBI中blast及进化分析表明，菰黑粉菌Rbf1基因与玉米黑粉菌具有较高的同源性；另外，菰黑粉菌不同生长阶段的Rbf1基因的表达量检测结果发现，Rbf1基因在菌丝生长前后表达量有显著差异，在菌丝生长12 h后表达量明显升高，表明Rbf1基因在菰黑粉菌的菌丝形成及生长过程中具有重要作用。

菰黑粉菌；Rbf1转录因子；菌丝生长

茭白（Zizanialatifolia），又称菰、茭笋、茭白草，为禾本科菰属多年生宿根草本植物，是原产于我国的一种重要水生蔬菜[1]。研究表明，茭白营养丰富，含有多种营养物质，其蛋白质功效高于面粉、大米和大豆，具有很高的食用价值[2]。此外，茭白还具有很高的药用价值，有研究表明，从茭白中提取出来的一种分子式为C31H54NaO3的白色晶体，能有效抑制成骨细胞的反常增殖，可用于预防骨质疏松症[3]。目前茭白广泛种植于亚洲各地，我国的种植面积也逐年增加。目前的研究认为，茭白的产生与茭白植株内的菰黑粉菌（Ustilagoesculenta）的侵染互作存在较大的关系[4]。菰黑粉菌侵染茭白成功后，茭白开花受到抑制，刺激茭白茎部膨大，形成可食用的膨大茎，并且组织切片观察发现正常茭白膨大茎部存在着大量的菰黑粉菌，此外在茭白地下茎、叶鞘和芽的维管束组织和薄壁组织也观察到菰黑粉菌的分布[5，6]。田间种植发现，除可食用的正常茭白外，通常也会发现大量的不可食用的灰茭。灰茭的膨大茎中充满黑色孢子，误食可能会造成过敏反应[7]，因此灰茭产生会对茭白的种植造成较大的经济损失。

菰黑粉菌是黑粉菌目黑粉菌科真菌，进化分析表明，其与玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）及玉米丝黑穗菌（Sporisorium reilianum）具有较高的亲缘关系，是一种典型的二型态真菌，存在菌丝型及酵母型两种形态，其形态转换及致病性与多种转录调节因子有关。Heimel等[8]研究发现，玉米黑粉菌中转录因子Rbf是玉米黑粉菌的侵染过程中主要调节因子，Rbf1基因缺失后，玉米黑粉菌能够形成菌丝，但是不能产生附着孢，导致其侵染性下降。另外，研究表明，在玉米黑粉菌由酵母型形成菌丝型后，Rbf1基因能够调节Kpp6、Hdp1、Hdp2、Biz1等基因的表达从而调控细胞周期，控制真菌的生长及附着孢形成等多个致病过程[9]。在侵入植物表皮后，Rbf1能够与Clp1形成复合物，从而调节信息素mfa及受体pra的表达，进而调节菌丝的形成。

目前认为在正常茭中菰黑粉菌通常以菌丝型形态存在，称之为MT型，而灰茭中则主要以酵母型形态存在，称为T型[10，11]。本课题组前期分别从龙茭2号正常茭和灰茭中分离得到MT型和T型菰黑粉菌。以MT型菰黑粉菌的转录组数据为基础设计基因特异引物，分别从MT型及T型黑粉菌中扩增得到Rbf1基因，并对其进行相应的序列分析。利用Real-time PCR技术检测Rbf1基因在不同形态及不同培养时期的相对表达量，结果表明Rbf1基因的表达与菰黑粉菌形态转换之间存在一定的关系。以上研究结果为进一步研究菰黑粉菌的形态转换机制及灰茭形成机理提供了一定理论基础。

1 材料方法

1.1 试验材料

①菌株 分离自龙茭2号MT型菰黑粉菌，分离自龙茭2号灰茭的T型菰黑粉菌。

②主要试剂和仪器 SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（生工），pMD19-T Vector（TaKaRa），RNAiso plus（TaKaRa），LA Taq（TaKaRa），PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒（TaKaRa），荧光定量试剂盒（TaKaRa）；普通PCR仪（Bio-Rad），核酸电泳仪（Bio-Rad），Gene Genius Bio Imaging System凝胶成像系统，StepOneTMReal-Time PCR System（ABI），光学显微镜（LEICAI DMI4000B）。

③培养基 YEPS培养基：蛋白胨 20 g、酵母粉10 g、蔗糖20 g、琼脂15 g，加水至1 000 mL，分装后高压蒸汽灭菌。

1.2 Rbf1基因的克隆

①菰黑粉菌Rbf1基因组序列的克隆 通过CTAB法对MT型菰黑粉菌及T型菰黑粉菌进行总DNA提取，利用特异引物对菰黑粉菌基因组DNA进行PCR扩增，获得其基因组相应序列，经克隆测序验证。

②菰黑粉菌总RNA的提取 分别收集MT型和T型菌丝型及酵母型菰黑粉菌，在液氮中充分研磨成粉末，根据提取说明书提取菰黑粉菌总RNA。

③Rbf1基因开放阅读框的扩增 采用Prime-ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成菰黑粉菌总RNA的cDNA第一链。同时根据MT型菰黑粉菌的转录组测序结果设计引物（表1），采用普通PCR扩增菰黑粉菌中Rbf基因，经割胶回收后，连接转化大肠杆菌JM109，菌液验证，挑取阳性克隆进行测序验证。分析其结构，并比较分析其与玉米瘤黑粉菌等进化关系。

1.3 Rbf1基因表达模式分析

①样品采集观察。以YEPS培养基活化、培养菰黑粉菌，待OD600为0.8～1.0时接种于YEPS固体培养基，28℃培养。观察培养过程中的菌落形态变化，分别收集培养0、12、24、36、48、60、72、84h后的菌体。3次重复，菌体收集后-80℃保存备用。

②荧光实时定量PCR检测基因的相对表达量。菰黑粉菌总 RNA的提取同 1.2，利用PrimeScriptRT regent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒反转录得到cDNA。利用获得的Rbf1 cDNA序列，按照qRT-PCR引物设计要求设计荧光特异性引物（表1）。以β-actin基因作为内参基因，以不同培养时期的cDNA为模板进行定量PCR扩增。荧光定量PCR采用SYBRGreenI染料法，反应在StepOneTMReal-Time PCR System（ABI）检测系统上进行。Realtime PCR反应液体系：qPCR反应体系（25 μL）为：Premix Ex TaqTM（2×）12.5 μL，PCR正向引物（10 μmol/ L）1 μL，PCR反向引物（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA1.0μL。反应程序为95℃30s；95℃30s，60℃15s，72℃延伸30s，进行40个循环，每个反应设置3个重复样品。荧光定量所得Ct值采用2-△△Ct法进行分析[12]。

2 结果与分析

2.1 菰黑粉菌Rbf1基因克隆及序列结构分析

根据转录组测序结果，实验设计了针对Rbf1基因的开放阅读框（ORF）的引物，分别提取MT型菰黑粉菌和T型菰黑粉菌RNA，反转录为cDNA，扩增得到相应的Rbf1基因的ORF序列，对两种菰黑粉菌的Rbf1序列进行比较分析。测序结果表明，两种菰黑粉菌中的Rbf1具有相同的ORF序列，其ORF共1281bp，编码426个氨基酸，理论分子量为109.59KDa，理论等电点为4.94。利用其编码序列，通过MegAlign软件采用近邻法构建系统进化树（图1A），结果表明，菰黑粉菌与玉米瘤黑粉菌及玉米丝黑穗菌具有较高的亲缘关系，可能具有类似的功能。

对菰黑粉菌Rbf1基因组序列进行PCR扩增后得到1281bp的基因组序列。通过NCBI中的Spidey程序将该基因组序列与Rbf1cDNA序列进行比对分析，发现其不含内含子。Rbf1包含一个保守结构域，编码一个核酸结合位点，同时编码一个锌指结构域（图1B）。

2.2 菰黑粉菌Rbf1基因表达差异分析

实验以YEPS分别培养T型菰黑粉菌及MT型菰黑粉菌，每隔12h观察生长状况及菌落形态，同时收集相应的菌体，-80℃保存。显微观察结果表明，T型菰黑粉菌在培养36h后开始产生明显菌丝（图2A），48 h后菌丝大量生长（图2B）；MT型菰黑粉菌则在培养60 h后产生菌丝（图2C），72 h后菌丝大量生长（图2D）。提取不同时间段的菰黑粉菌RNA，并反转录为cDNA，通过实时定量PCR检测在不同培养时间段Rbf1基因的相对表达量。结果表明，T型菰黑粉菌在培养48 h后，Rbf1基因的表达量达到最大，而MT型菰黑粉菌则在72 h后表达量最大，2种黑粉菌均在菌丝生长12 h后达到最大表达量（图3）。

3 讨论与结论

目前的研究表明，菰黑粉菌在茭白孕茭的过程中发挥着重要作用。研究发现，在茭白孕茭的早期阶段，菰黑粉菌较少，其菌丝的大量增殖可能与茭白膨大密切相关[5]。 进化分析表明，菰黑粉菌与玉米黑粉菌具有较高的亲缘关系，因此推测菰黑粉菌对茭白的侵染机制可能与玉米黑粉菌相似，都必须由酵母型形态转换为菌丝型形态，进而侵入植物表皮细胞，获取营养。在玉米黑粉菌的侵染过程中，菌丝的生长主要由信息素及信息素受体系统调节；而在菌丝生长后，Rbf1基因大量表达调控下游基因Biz1、Hap1等，进而调节附着胞的形成及对植物表皮的穿透，完成整个侵染过程。同时，Rbf1能够与Clp1、Cib1基因结合形成复合物，反馈调节信息素的表达，影响菌丝的形成[13]。

本试验在转录组测序的基础上，通过PCR扩增得到T型和MT型菰黑粉菌的Rbf1基因组序列及RNA序列，并对其基本特点进行分析，明确其基本结构。同时实验结果表明，Rbf1因子的表达与菰黑粉菌的菌丝生长有一定的关联。无论是T型菰黑粉菌还是MT型菰黑粉菌，在培养初期菌丝形成阶段，Rbf1基因一直处于低表达水平，没有明显的变化；菌丝形成后12 h，T型菰黑粉菌与MT型菰黑粉菌中Rbf1因子的表达量均显著上调，随后逐步下降。因此，与玉米黑粉菌类似，菰黑粉菌中Rbf1基因在菌丝的形成及快速生长过程中起着重要作用，可能与玉米黑粉菌类似，参与反馈调节信息素的表达。

在本实验的基础上，后续可进一步筛选可能的与其相互作用的其他基因，同时可通过基因敲除及回补深入研究Rbf1基因在菰黑粉菌菌丝生长及对茭白的侵染作用，为阐明茭白的孕茭机制提供理论基础。

[1]Piepenbring M,Stoll M,Oberwinkler F.The generic position ofUstilago maydis,Ustilago scitaminea,andUstilago esculenta (Ustilaginales)[J].Mycological Progress,2002,1 (1):71-80.

[2]闫宁，徐晓峰，范菁，等.温室栽培对茭白生长与叶片光合特性的影响[J].长江蔬菜，2011（16）：27-30.

[3]Kawagishi H,Hota K,Masuda K.Osteoclast-Forming suppressive compounds from Makomotake,Zizania latifoliaInfected withUstilago esculenta[J].BiosciBiotechnol Biochem, 2006,70(11):2 800-2 802.

[4]郭得平，李曙轩，曹小芝.菰黑粉菌某些生物学特征的研究[J].浙江农业大学学报，1991，17（1）：80-84.

[5]Zhang J Z,Chu F Q,Guo D P,et al.Cytology and ultrastructure of interactions betweenUstilago esculentaand Zizania latifolia[J].Mycol Progress,2012,11:499-508.

[6]尤文雨，叶子弘，刘倩，等.我国茭白的生物学研究[J].长江蔬菜，2008（21）：35-38.

[7]Fujii Y,Usui Y,Konno K,et al.A case of hypersensitivity pneumonitis caused by smut spores ofUstilago esculenta[J]. Japanese Respiratory Society,2007,45(4):344-348.

[8]Heimel K,Scherer M,Vranes M,et al.The transcription factorRbf1is the master regulator for b-mating type controlled pathogenic development inUstilago maydis[J].PLoS Pathog,2010,6(8):e1001035.

[9]Vollmeister E,Schipper K,Baumann S,et al.Fungal development of the plant pathogenUstilago maydis[J].FEMS Microbiology Reviews,2012,36(1):59-77.

[10]李志兰，尤文雨，邹克琴，等.菰黑粉菌孢子萌发过程形态学观察及系统发育研究[J].中国计量学院学报，2012，21（2）：140-145.

[11]You W,Liu Q,Zou K,et al.Morphological and molecular differences in two strains ofUstilago esculenta[J].Curr Microbiol,2011,62(1):44-54.

[12]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T))method[J].Methods(San Diego,Calif), 2001,25(4):402-408.

[13]Heimel K,Scherer M,Schuler D,et al.The Ustilago maydis Clp1 protein orchestrates pheromone and bdependent signaling pathways to coordinate the cell cycle and pathogenic development[J].Plant Cell,2010,22(8): 2 908-2 922.

Cloning and Expression Analysis of Transcription FactorRbf1fromUstilago esculenta

HU Peng,ZHANG Yafen,CUI Haifeng,YU Xiaoping,YE Zihong
(College of Life Sciences,China Jiliang University,Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection&Quarantine,Hangzhou,Zhejiang 310018,China)

For the study ofUstilago esculentamorphological transformation mechanism and formation mechanism of grey Jiaobai，theRbf1gene was cloned in twoU.esculentastrains isolated from white Jiaobai(MT-type)and grey Jiaobai(T-type),based on analysis of the genome and transcriptome sequencing data.Sequence analysis results indicated that the Rbf1gene sequence was conservative in the two strains,with the open reading frame(ORF)of 1 281 bp without intron. The NCBI blast and phylogenetic analysis showed that the Rbf1 had highest homology compared to that inU.maydis.In addition,microscope observation and real-time analysis results showed thatRbf1was up-regulated after the hyphae formed and to be the highest 12 h later,indicating the importance in hyphae formation and growth.

Ustilago esculenta;Transcription factorRbf1;Hyphae growth

S645.2；Q781；Q786

A

1001-3547（2015）22-0198-04

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.22.072

浙江省自然科学基金（LQ15C140003）；国家科技支撑计划项目（2012BAD27B01）；国家自然科学基金项目（3147085）

胡鹏（1990-），男，硕士，研究方向为植物与微生物互作，E-mail：hpq990@163.com.

叶子弘，通信作者，电话：0571-86836062，E-mail：zhye@cjlu.edu.cn

2015-10-14