何 帅，胡廷章

（1.重庆医科大学生命科学研究院，重庆400016；2.重庆大学生命科学研究院，重庆400044）

OsLEA5蛋白对乳酸脱氢酶体外保护机制的研究

何 帅1，胡廷章2

（1.重庆医科大学生命科学研究院，重庆400016；2.重庆大学生命科学研究院，重庆400044）

目的确定胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA蛋白）在体外不同压力胁迫下对酶活性的保护作用，并对其可能机制进行探讨。方法评估OsLEA5蛋白对于防止乳酸脱氢酶（LDH）免受高温（43℃）、反复冻融和干燥脱水伤害的保护能力。磷酸盐缓冲液、牛血清蛋白（BSA）和纯水分别用于阳性和阴性对照。结果OsLEA5蛋白组相对活性百分比在热处理10、20、30 min后分别是纯水对照组的2.2、3.7、5.4倍。在5个反复冻融循环后，纯水对照组的LDH活性降至7%甚至更低，而质量比2∶1和5∶1的OsLEA5蛋白组分别为28%和69%，质量比为10∶1组其活性几乎未受到影响。经过干燥处理后，不同质量比组LDH活性均有明显降低，其中纯水对照组和磷酸盐缓冲液组的LDH接近完全失活。质量比为5∶1和10∶1的OsLEA5蛋白组相对活性分别达24%和36%。结论OsLEA5蛋白能够在各种环境胁迫下有效保护底物酶的体外活性或防止失活。

L-乳酸脱氢酶； 植物蛋白质类； 高温，诱发； 反复冻融； 脱水

通常在环境压力下，细胞的基因表达调控体系会有变化，原有的一些正常蛋白质合成途径受到抑制，同时还会诱导出许多新蛋白的合成，植物胚胎发育晚期丰富蛋白（LEA蛋白）就是其中之一[1]。LEA蛋白是一种小分子的特异性亲水多肽，在干旱条件下细胞会积累一系列LEA蛋白来保护细胞膜系统和生物大分子，以减少脱水损伤，其分子作用机制丰富多样，如束缚离子、防止蛋白聚集、稳定酶的功能和结构等[2]。近年来，许多研究已揭示了一些LEA蛋白能够有效保护乳酸脱氢酶（LDH）免受冷冻的伤害，此外，还有报道该类蛋白保护柠檬酸合成酶（CS）、延胡索酸酶和苹果酸脱氢酶等免受脱水伤害的实验证据[3]。但值得注意的是，同样高度亲水的其他蛋白却不能像LEA蛋白一样具有这些保护功能[4]。不过，目前对于LEA蛋白的确切作用机制还有待进一步阐明。为了确定LEA蛋白在不同压力条件下对酶体外活性的保护作用，作者研究了OsLEA5蛋白对于LDH在高温、冷冻和干燥环境压力下的活性变化情况。截至目前，所有这些因外界压力胁迫而失活产生变性蛋白或聚集物的机制并不十分清楚[5]。

1 材料与方法

1.1 材料 来源于家兔肌肉的LDH和牛血清蛋白（BSA）购于美国Sigma公司，OsLEA5蛋白由重庆大学生命科学院胡廷章教授的实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 LDH的胁迫处理 首先用100 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH=6.0）将LDH稀释至终浓度为0.1 mg/mL的LDH稀溶液。磷酸盐缓冲液（PBS）、BSA和纯水分别用于阳性和阴性对照。热胁迫处理：分别将2 μL的纯水、PBS、BSA和OsLEA5蛋白加入到20 μLLDH稀溶液中，在43℃水浴锅中孵育，分别于10、20、30 min指定时间取出2μL混合液，冰上放置5 min后进行活性检测。冷冻胁迫处理：将一定量的纯水、PBS、BSA和OsLEA5蛋白加入到一定量的LDH稀溶液中，分别制成质量比（保护剂为LDH）为2∶1、5∶1和10∶1的混合液。将这些混合液用液氮迅速冷冻，停留1 min，然后于室温下放置10 min。上述步骤即为1个冻融循环，每个样本如此重复5次。干燥胁迫处理：同冷处理一样，制成质量比（保护剂∶LDH）为2∶1、5∶1和10∶1的混合液。将上述混合液在相对湿度为50%、温度25℃的空气流中干燥5 h，然后立即加纯水至原体积实现再水合，最后在室温下放置10 min。

1.2.2 LDH活性测量 将2μL经胁迫处理后的样本加入到 1 mL的活性测定缓冲液（100 mmol/L PBS、0.1 mmol/L烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、2 mmol/L丙酮酸盐）中。然后在波长为A340的分光光度计中检测1 min，LDH活性即被测定。在本实验中，纯水作为空白对照，所有数值均以已处理样本相对于未处理样本的相对活性百分比表示，所有样本重复3次。

2 结 果

2.1 OsLEA5蛋白对LDH在高温条件下的失活保护研究 在43°C高温处理30 min后，没有保护剂的LDH组逐渐丧失活性至原来的12%，含有PBS的LDH组其活性也显著降低。随着热处理时间的延长，失活的程度越大，OsLEA5蛋白组的相对活性百分比在热处理10、20、30 min后分别是纯水对照组的2.2、3.7、5.4倍。见图1。

图1 OsLEA5蛋白和纯水、PBS、BSA在高温条件下保护LDH的体外活性比较

2.2 OsLEA5蛋白对LDH在反复冻融条件下的失活保护研究 在5个反复冻融循环以后，纯水对照组的LDH相对活性百分比降至7%甚至更低。而质量比2∶1和5∶1的OsLEA5蛋白组的LDH相对活性百分比分别为28%和69%，蛋白含量更高的质量比为10∶1组，其活性几乎未受到影响。相比之下，作为已知的有效抗冻剂BSA的保护能力比OsLEA5蛋白差一些，最高质量比也只有65%，然而PBS组被证明基本无保护作用。OsLEA5蛋白对LDH的保护能力从质量比2∶1～10∶1的范围内，随着浓度的增大而不断增强。见图2。

2.3 OsLEA5蛋白对LDH在干燥脱水条件下的失活保护研究 经过剧烈干燥再水合后，不同质量比组LDH活性均有明显降低，其中纯水对照组和PBS组的LDH接近完全失活。形成强烈对比的质量比5∶1和10∶1的OsLEA5蛋白的LDH相对活性百分比分别达24%和36%。见图3。

图2 OsLEA5蛋白和纯水、PBS、BSA在反复冻融条件下保护LDH的体外活性比较

图3 OsLEA5蛋白和纯水、PBS、BSA在干燥失活条件下保护LDH的体外活性比较

3 讨 论

水分缺失是阻碍细胞生长发育的关键性因素，所以各种有关细胞代谢变化的基因被诱导出来以应对外界压力，其中就包括了LEA蛋白的出现。近年来，有关LEA蛋白的体外功能机制研究一直是一个热点，很多研究已证明LEA蛋白与细胞抵抗各种非生物胁迫之间联系紧密[6-7]。在本研究中，OsLEA5蛋白作为非典型的第5组LEA蛋白，是自然折叠的、疏水的，这与常规LEA蛋白的典型特征恰好相反，揭示了该组LEA蛋白在作用机制和理化功能上有不同于传统亲水LEA蛋白的特点。

多年来，该领域面临的最大问题是：到底LEA蛋白是全面多能、功能强大还是捉摸不透、难以揣测。有学者普遍认为，LEA蛋白保护细胞免受脱水伤害，可能是充当多功能的水结合分子、分子屏障、膜稳定剂和空间填充剂及分子伴侣，以防止细胞塌陷[3]。之所以会如此多才多艺，推测是由于其天然的无序结构，这种结构上的灵活和柔韧使得LEA蛋白很容易通过空间构象变化与目的蛋白结合，从而起到保护作用[8]。虽然这些是常规LEA蛋白所具备的，但OsLEA5蛋白这类非典型LEA蛋白也有其优势。一方面，尽管OsLEA5蛋白不是无序的不稳定构象，但相对于其他非LEA蛋白，仍然有比较理想的结构可塑性和柔软性，其在水相中能以更低的水活度变得更加折叠或附着在膜表面[9]；另一方面，这类LEA蛋白可能存在某种分子伴侣机制，很容易用OsLEA5蛋白的疏水性来解释，因为疏水蛋白会促进聚集物暴露于表面通过暂时的疏水相互作用[10]。根据传统分子伴侣理论，OsLEA5蛋白可以解开在压力条件下相互聚集的大分子，从而提高其他正在折叠的分子伴侣或酶活性。

干燥处理可以导致细胞缺水，这对细胞内的各种细胞器、细胞膜和酶都是有害的。在本研究中作者发现，OsLEA5蛋白能够在脱水胁迫下有效维持LDH的活性。因此，其疏水蛋白可能作为高渗保护分子在缺水压力下发挥着比亲水蛋白更有力的功能。另外，这些LEA蛋白可能通过聚集成更大分子保护酶分子的完整性并帮助胁迫之后的复原[11]。总之，作者认为，OsLEA5蛋白可以通过稳定分子构象和滞留水分子而缓解由脱水带来的伤害。

反复冻融所带来的影响也是多方面的，包括脱水、结晶、高渗和过氧化[12]。实际上，即使没有甘油等抗冻剂的保护，仅冰冻1次的酶活性不会受到影响，但是对反复冻融却很敏感。酶的活性减弱程度取决于反复冻融的重复次数，而不是每次冰冻持续的时间[13]。因此，在该研究中选择了反复冻融法来验证OsLEA5蛋白对LDH的抗冰冻保护作用，结果发现OsLEA5蛋白能有效防止LDH在反复冻融伤害中的失活。当蛋白质面临低温时，很多都会变性失活，此时OsLEA5蛋白发挥保护功能可能是由于它能够使蛋白质维持高级结构和天然折叠。也有学者认为，LEA蛋白在受到低温胁迫时可以防止酶分子的晶体化，并且作为“分子屏障”在相邻酶分子间形成物理屏障，从而阻止其聚集[14]。所以，有理由推断OsLEA5蛋白与热休克蛋白类似，能够保护蛋白质免受极端温度带来的伤害。

综上所述，OsLEA5蛋白在回应高温、冷冻和干燥的非生物胁迫时展现了多重保护能力。需要强调的是，OsLEA5蛋白具有功能多样性，这种多样性可能是由于自由无序和疏水性，使其面对各种复杂的环境因素时更加有利。但是需要有进一步的深入研究来彻底判断LEA蛋白的准确功能和真实身份。作者希望本研究能够为将来进一步全面阐明LEA蛋白的分子作用机制提供一定的基础。

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A study of protection mechanism of OsLEA5 proteins on lactic dehydrogenase（LDH）in vitro

He Shuai，Hu Tingzhang
（Academy of Bioscience，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China；2.Academy of Bioscience，Chongqing University，Chongqing 400044，China）

ObjectiveTo determine the protective effect of late embryogenesis abundant（LEA）protein on enzyme activity under different stresses in vitro and discuss its potential mechanism.MethodsThe protective capability of OsLEA5 proteins to prevent lactic dehydrogenase（LDH）from high temperature（43℃），multigelation and dehydration was tested.Phosphate buffer，BSA and pure water were respectively used as positive and negative controls.ResultsThe percentage of OsLEA5 proteins′relative activity was 2.2，3.7，5.4 times higher than pure water′s after 10，20，30 min of heat treatment.Pure water′s LDH activity dropped to 7%or even lower after 5 multigelation cycles while OsLEA5 proteins with a mass ratio of 2∶1 and 5∶1 were 28% and 69%，and OsLEA5 protein with a mass ratio of 10∶1 remained uninfluenced.The LDH activity of different mass ratios clearly dropped after drying treatment，in which pure water and phosphate buffer′s LDH was almost completely inactivated，and OsLEA5 proteins with a mass ratio of 5∶1 and 10∶1 was 24%and 36%.ConclusionOsLEA5 proteins effectively protect substrate enzyme′s activity in vitro and prevent inactivation under various stress conditions.

Lactate dehydrogenases； Plant proteins； Hyperthermia，induced； Multigelation； Dehydration

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.10.002

：A

：1009-5519（2015）10-1445-03

2015-03-24）

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教育部“春晖计划”（Z2007-1-63006）；中国博士后科学基金（No.20070420717）。

何帅（1987-），男，湖南茶陵人，博士研究生，主要从事抗逆分子生物学的研究；E-mail：61848265@qq.com。