符小航 符海鸽 贺丰杰 车虹彩 杨鉴冰 崔晓萍

陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712046)

归肾育宫汤对免疫性卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞Fas/FasL蛋白表达影响的实验研究*

符小航 符海鸽△贺丰杰▲车虹彩 杨鉴冰▲崔晓萍▲

陕西中医药大学第二附属医院(咸阳 712046)

目的：观察归肾育宫汤对卵巢早衰小鼠卵泡细胞Fas/FasL蛋白表达的影响，揭示该方治疗卵巢早衰的作用机制。方法：60只雌性昆明小鼠，随机分成正常组、模型组、阳性对照组、归肾育宫汤大、中、小剂量组，每组10只；采用免疫法复制小鼠卵巢早衰模型，给药4周后，HE染色观察病理组织学变化，免疫组化法检测卵泡颗粒细胞Fas/FasL蛋白表达。结果：各组大鼠卵泡颗粒细胞Fas/FasL的表达比较，归肾育宫汤大、中剂量组、阳性对照组与模型组有显著性差异(P<0.01)；组间比较，归肾育宫汤大、中剂量组优于雌激素组(P<0.01)。结论：归肾育宫汤能有效抑制卵泡颗粒细胞Fas/FasL蛋白的表达，对卵巢早衰小鼠的卵巢颗粒细胞过度凋亡有抑制作用。

卵巢早衰(Premature ovarian failure，POF)是指40岁之前妇女出现持续性闭经，并伴有促卵泡生成素和促黄体生成素升高、雌激素降低的综合征[1]。因其病因复杂，发病机制不明，治疗难度大，是目前妇科中的难治疾病之一。陕西省名中医杨鉴冰教授根据“肾主生殖”理论，结合多年临床实践创立了以“补肾”为主要治法的归肾育宫汤，该方由熟地、枸杞子、山萸肉、菟丝子、山药、茯苓、紫河车、鹿角霜、杜仲、川断、制首乌、鸡血藤、焦山楂、炙甘草组成，大队补阴药中配伍少量补阳药以阳中求阴，具有滋补肾精、充养胞宫的功效，经多年临床验证疗效确切。现代研究表明，卵巢颗粒细胞过度凋亡是导致卵巢早衰的主要原因之一，卵巢颗粒细胞既能分泌雌激素和孕激素，又在卵泡的发育和成熟中发挥着重要作用，因此，调节卵泡颗粒细胞的凋亡可能为治疗卵巢早衰提供新的靶点。故本实验采用透明带多肽多点注射免疫法复制卵巢早衰小鼠模型，通过观察归肾育宫汤对模型小鼠卵巢颗粒细胞调控蛋白Fas/FasL的影响，探讨该方的作用机理，为中医药治疗POF提供依据,现将实验结果汇报如下：

1 材 料

1.1 动物 雌性昆明小鼠60只，体重(20±5)g，合格证号：SCX(陕)2007-001，西安交通大学医学实验动物中心提供。

1.2 药物及试剂 归肾育宫汤组方：枸杞子、川断各12g，菟丝子20g，熟地、山萸肉、杜仲、紫河车、鹿角霜各10g，茯苓、山药、制首乌、鸡血藤、焦山楂各15g，炙甘草6g，所有中药材购于百姓乐大药房，经陕西中医药大学中药教研室鉴定为合格药品，常规煎煮浓缩后备用；结合雌激素片：新疆新姿源生物制药有限责任公司，批号：20130402。

1.3 透明带多肽3(ZP3) 美国GenScript公司，纯度98.1%，批号：5004321_1；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂: 美国Sigma 公司；Fas、FasL一抗：北京博奥森生物技术有限公司。

1.4 仪器与设备 图像采集系统 NIKON.ACT-1 DXM1200 日本尼康公司；光学显微镜：蔡司光学仪器(上海)国际贸易公司。

2 方 法

2.1 POF模型制备 ①取ZP3粉末1.4445mg溶入1mL三蒸水中配置成ZP3溶液；②ZP3溶液分别和和弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂按1∶1配制成免疫试剂和免疫强化试剂；③分别于第1天和第14天取0.1mL免疫试剂和免疫强化试剂注射于小鼠双后脚掌及腹腔皮下。

2.2 分组及给药 60只雌性昆明小鼠称重后，根据体重分层，采用随机法分为正常组、模型组、阳性对照组、归肾育宫汤大、中、小剂量组，每组10只。阳性对照组用结合雌激素片0.125mg/kg·d，各治疗组按归肾育宫汤大剂量组70g/kg·d、中剂量组35g/kg·d、小剂量组17.5g/kg·d灌胃，正常组、模型组灌胃相同量生理盐水，连续灌胃4周。

2.3 卵泡颗粒细胞 Fas、FasL蛋白表达的测定：取小鼠卵巢，制成厚度3μm，脱蜡脱水，3%双氧水室温孵育10min，蒸馏水冲洗、PBS浸泡5 min，2次，10%山羊血清封闭，室温孵育10min，分别滴加Fas、FasL一抗4℃过夜，二抗37℃孵20min，滴加适量辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育20min，显色剂显色3～15min，冲洗、复染、脱水、透明、封片后显微镜下观察。采用Zeiss ImergerAl显微镜观察到阳性细胞后，用DXM1200FCCD图像采集系统采集图片，对采集到的图像应用Image-Pro Plus5.1分析系统测定其积分光密度。

3 结 果 归肾育宫汤对卵巢早衰小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达的影响 正常组小鼠卵泡颗粒细胞Fas蛋白很少表达，FasL蛋白呈弱阳性表达；与空白组比较，模型组小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达显著增强(P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组，归肾育宫汤大、中、小剂量组小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达明显减弱(P<0.01)，表明雌激素、归肾育宫汤均可通过降低小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白的表达抑制卵泡颗粒细胞的过度凋亡；与阳性对照组比较，归肾育宫汤大、中剂量组小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达减弱(P<0.01)，小剂量无差异(P>0.05)；归肾育宫汤各治疗组间比较，各组间小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达均有差异(P<0.01)，表明归肾育宫汤对小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达的影响与剂量成正比关系。结果见表1。

表1 各组大鼠结肠上皮细胞Fas、FasL蛋白积分光密度(IOD)的比较

注：与正常组比较，▲P<0.01；与模型组比较，◆P<0.01；与阳性对照组比较，●P<0.01；与大剂量组比较，△P<0.01

4 讨 论 目前卵巢早衰的发病率逐年上升，多位学者从不同角度对卵巢早衰的病因进行了研究，分子、基因、蛋白等多个层次的研究结果均表明在卵泡颗粒细胞凋亡是导致卵巢早衰的重要原因[2-3]。Fas及其配体FasL是一对调节细胞凋亡的蛋白因子，FasL蛋白能与Fas特异性亲和，激活Fas蛋白介导的信号通路[4]。因此调节Fas及其配体FasL的表达，能有效抑制卵泡颗粒细胞的过度凋亡对卵巢早衰起到治疗作用。朱萱萱[5]等研究表明，卵巢早衰大鼠存在卵泡颗粒细胞的过度凋亡以及Fas/FasL蛋白表达的失衡。本此实验根据自身免疫异常的机制采用透明带多肽成功复制了POF小鼠动物模型，模型成功后可见Fas、FasL蛋白表达的显著升高，经归肾育宫汤给药治疗后，可见阳性对照组、大、中、小剂量组小鼠卵泡颗粒细胞Fas、FasL蛋白表达，组间比较发现归肾育宫汤大、中剂量组药物疗效优于阳性对照药，表明归肾育宫汤能通过调节Fas/FasL蛋白表达间的平衡抑制卵泡颗粒细胞过度凋亡对卵巢早衰起到治疗作用。

[1] 曹泽毅.中华妇产科学[M].北京：人民卫生出版社,1999：138

[2] 刘慧萍,尤昭玲,雷 磊,等.补肾活血方对免疫性卵巢早衰小鼠卵泡凋亡调控基因( Bcl-2 /Bax) 蛋白的影响[J].中华中医药学刊，2010,28(5):1036-1038．

[3] Massin N，Meduri G，Bachelot A，et al． Evaluation of different markers of the ovarian reserve in patients presenting with premature ovarian failure[J].Mol Cell Endocrinol，2008，282( 1-2) : 95-100．

[4] Coffey JC,Bennett MW,Wang JH,et al.Up regulation of Fas-FasL(CD95/CD95L)-mediated epithelial apoptosis[J].A putative role in pouchitis? J Surg Res,2001，98(1):27-32.

[5] 朱萱萱,王海丹,王 进,等.乌鳖颗粒对免疫性卵巢早衰小鼠 CD4+/CD8+及 Fas,FasL 蛋白表达的实验研究[J].中华中医药学刊,2012,29(12): 2605-2607.

(收稿2015-06-17；修回2015-07-10)

*陕西省教育厅项目(11JK0693)

△兴平海派医院(兴平713100)

▲陕西中医药大学(咸阳712046)

卵巢早衰/中医药疗法 @归肾育宫汤 动物，实验 小鼠

R711.75

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2015.10.089

陕西省中医药管理局项目(13-JC003)

陕西中医学院第二附属医院院内项目(201201)