徐伟良， 陈德经,2， 魏 泓， 刘 宇

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000；3.第三军医大学 基础部实验动物学教研室， 重庆 400038)

大鲵皮肤黏液的抗氧化性及安全性评价研究

徐伟良1， 陈德经1,2， 魏 泓3， 刘 宇3

(1.陕西理工学院 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000；2.陕西理工学院 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000；3.第三军医大学 基础部实验动物学教研室， 重庆 400038)

大鲵； 皮肤黏液； 毒性； 抗氧化

大鲵(AndriasdavidianusBlanchard)属于大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，国家二级保护动物，有活化石之称[1]。大鲵皮肤腺体主要有两种：粘液腺(mucus gland)和颗粒腺(granular gland)。粘液腺分泌出清澈粘液，覆盖在身体表面形成一层湿润的薄膜，具有防御、繁殖、保湿、皮肤呼吸、温度调节、pH调节等作用[2-3]；颗粒腺又叫毒腺，在皮肤局部聚集形成特殊的腺体结构，能够分泌抗菌肽和药理活性肽等生物活性物质[4-5]。当大鲵机体受到外界不良刺激时，能分泌白色黏液，并带有一定特殊性臭味。自然界中，生物体经常通过自身分泌的气味来进行生物信息传递和交换，特别是在避敌、引诱、觅食、导航以及维持群居的动物社会等方面，气味的作用尤为突出[6-7]。大鲵皮肤黏液对抗菌、抗氧化等方面起着非常明显的作用[8-9]，曲敏等[10-11]从大鲵体表黏液中分离获得了黏液低聚糖肽，并证明了该糖肽具有抗氧化性，对羟自由基有明显的清除作用。此外，Guo等[12]发现大鲵皮肤黏液具有复杂毒性作用，经腹腔给药可使小鼠致死，低剂量可导致小鼠出现水肿或痛觉效果。

大鲵皮肤黏液中含有多种活性成分，可作为天然药用资源进行开发利用。但大鲵黏液具有很强的黏附性和特殊的臭味，且特殊性臭味是什么成分，是否具有毒性，目前尚未见文献明确报道，限制了大鲵黏液的开发与利用。通过干燥处理形成的粉剂能够减轻臭味，具有性状稳定，剂量准确，便于运输和贮存等特点[13]，是合理利用大鲵黏液的有效途径。因此，本研究通过对大鲵皮肤黏液抗氧化性和急毒性安全性评价，为大鲵皮肤黏液的开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

成熟大鲵(陕西汉源生物科技有限公司提供)；FVB/N品系小鼠(第三军医大学基础部实验动物中心提供)；体积分数1%羧甲基纤维素钠；0.1 mol/L Tri-HCL缓冲液(Ph 8.20，内含1 mmol/L EDTA·2Na)；4.5 mmol/L邻苯三酚盐酸溶液(用10 mmol/L盐酸配置)；50 g/L三氯乙酸(TCA)溶液(含5 mmol/L EDTA·2Na)；0.02 mg/mL DPPH溶液(避光保存)，所用试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪 器

GC6890N/MSD5973N联用仪(Agilent公司)，722G可见分光光度计(上海仪电分析仪器有限公司)，LC-800低速离心机(科大创新股份有限公司)，KQ-100DA型数控超声清洗器(苏州江东精密仪器有限公司)，PHS-2C型精密酸度计(上海大普仪器有限公司)DZF-6050型真空干燥箱(上海恒科技有限公司)，FA2004N电子天平(上海科学精密仪器有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 大鲵黏液全粉抗氧化性测定

1.2.1.1 大鲵皮肤黏液的采集

采用机械刺激法：用软毛刷轻轻拍打或按摩大鲵背部、尾部等皮肤分泌腺较多部位，对其进行温和刺激，使大鲵分泌产生白色黏液，并刮取黏液，-20 ℃下保存待用。

(1)邻苯三酚自氧化速率测定

参照改进的邻苯三酚自氧化法[14-15]。在试管中按表1加入0.1 mol/L Tris-HCl(内含1 mmol/L EDTA)缓冲液和去离子水，于25 ℃保温20 min，然后加入25 ℃预热过的4.5 mmol/L邻苯三酚，迅速摇匀，立即倾入比色杯中，在波长325 nm处每30 s测定一次吸光度值，共记录4 min内的吸光度值，并计算对照组的邻苯三酚自氧化速率△A0(min-1)，使其自氧化速率控制在0.06△A0(min-1)左右。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定加样表

(2)大鲵黏液超氧阴离子自由基清除率测定

称取1.00 g大鲵黏液，用10 mL双蒸水定容，超声震荡溶解，经4 000 rpm/min低速离心10 min，得上清液即为大鲵黏液制备液。按表1数据进行操作，将制备液按10 μL的梯度差从10～100 μL依次加入各试管中，同时减少同体积的双蒸水，其它操作的数据均与表1相同，并计算加样后抑制邻苯三酚自氧化速率△A1(min-1)：

(1)

1.2.1.3DPPH自由基清除率测定

参照Nedadis的方法考察大鲵黏液对DPPH的清除能力[16-17]。称取大鲵黏液1.0g，加入双蒸水定容至10mL容量瓶中，充分溶解后于4 ℃、12 000r/min离心10min，取上清液即为样品液。分别取100、200、300、400、500μL样品液与2mLDPPH溶液混合，加双蒸水补足至总体积为3mL，25 ℃下保温30min，双蒸水调零，在515nm下测定样品的吸光度值并记为A。与样品液体积相同的双蒸水与DPPH溶液混合作为试剂对照组，同样条件下，测其在515 nm下的吸光度值并记为A0。

DPPH自由基清除率计算：

(2)

1.2.2 大鲵黏液的急毒性安全性评价

1.2.2.1 受试物的处理

称取20g大鲵皮肤黏液，在40 ℃条件下真空干燥成大鲵黏液全粉；另取20g大鲵黏液于三角瓶中，加入20mL无水乙醇震荡洗涤30min，4 000r/min离心10min，真空干燥上清液和黏液沉淀，合并制备成大鲵黏液乙醇脱毒全粉作为实验对照品。分别称取一定量的大鲵黏液全粉及乙醇脱毒全粉，溶解在1%羧甲基纤维素溶液中，配制成不同剂量的混悬液。

1.2.2.2 急毒性实验

参考Horn氏法[18-19]，计算大鲵黏液全粉半数致死量(LD50)。分别配制1.0、2.15、4.64、10g/kg四个样品剂量，每个剂量组以四只体重相近的小鼠进行试验，试验前动物隔夜空腹(禁食16h左右，不限制饮水)。采用经口灌胃法，一次性给予不同剂量大鲵黏液全粉溶液，各剂量组的灌胃体积相同(0.4mL/只)；以体积分数1%羧甲基纤维素作为溶剂对照组，以乙醇脱毒全粉溶液为对比实验组，按上述操作，进行同样处理。观察指标包括小鼠外观、行为、死亡情况(死亡时间、濒临死亡前的反应)等，观察时间为14d，对死亡小鼠和观察期满(14d)存活小鼠处死进行大体解剖，进行病变组织器官检查。

1.2.3 大鲵皮肤黏液毒性成分检测

1.2.3.1 大鲵黏液预处理

取5g大鲵皮肤黏液于三角瓶中，加入5mL无水乙醇震荡洗涤30min，4 000r/min离心10min，吸取定量上清液至样品瓶中。另取5g大鲵黏液乙醇脱毒全粉溶于乙醇中，作为对照组。

1.2.3.2 固相微萃取条件[20]

将装有定量上清液的样品瓶置于60 ℃恒温水浴30min，将SPME萃取头插入样品瓶中固定刻度, 直接接触萃取30min后取出，迅速插入气相色谱进样口内，解析7min后取出SPME开始测定，然后同美国NIST05谱库比对，确定气质联用仪分析的气体成分。

1.2.3.3 气体检测方法[21]

(1)色谱条件：色谱柱为HP-5(30m×0.32mm，0.25μm)弹性石英毛细管柱，程序升温为以4 ℃/min的升温速率由80 ℃程序升温至290 ℃，恒温保持30min，进样口温度为250 ℃，载气(He)流量为1.0mL/min，传输线温度为280 ℃。

(2)质谱条件：MSD离子源为EI源，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，电子能量70eV，质量扫描范围(m/z)35～350。

2 结果与分析

2.1 超氧阴离子自由基清除率测定结果

通过对邻苯三酚自氧化速率与大鲵黏液抑制邻苯三酚自氧化速率的测定，计算所得的超氧阴离子自由基清除率结果如表2。

表2 超氧阴离子自由基清除率测定结果表 (1.00 mg/mL)

2.2 DPPH自由基清除率测定结果

通过对照管吸光度值A0和样品管吸光度值A的测量，计算所得大鲵黏液对DPPH清除率结果如表3。

表3 黏液对DPPH自由基的清除率 (26.75 mg/mL)

由表3可知，大鲵黏液对DPPH自由基有明显的清除作用，最高可达90.25%；在浓度为26.75～133.75 mg/mL的浓度范围内，随样品浓度增大，清除率逐渐增强。

2.3 小鼠急毒性实验结果

小鼠灌胃饲养实验中样品剂量和小鼠急毒性死亡情况如表4所示。

表4 急毒性实验记录表

由表4小鼠灌胃给药处理显示，经10 g/kg和4.64 g/kg大鲵黏液全粉处理后，小鼠均有3只死亡。死亡小鼠约0.5～2 h内出现呼吸急促、流涎，呆滞等表现。对死亡小鼠解剖显示出现肺部充血，胃部水肿的现象，其它内脏重要器官(心、肝、脾、肾及肠道等)未见充血、水肿及明显器质性变化。而经过乙醇脱毒处理的大鲵黏液全粉样品组与溶剂对照组小鼠表现正常，小鼠解剖未出现肉眼可见病理变化，也无明显毒性反应出现。因此，查Horn氏表有符合LD50值为4.64 g/kg，可信限范围为2.25～9.57。

2.4 黏液毒性成分检测结果

大鲵皮肤黏液乙醇脱毒上清液挥发性成分的GC-MS色谱图如图1所示。

图1 大鲵皮肤黏液气体GC/MS总离子流图

与美国NIST05谱库比对结果显示，黏液挥发性成分为二甲基二硫醚(C2H6S2)和正十四烷酸甲酯、正十五烷酸甲酯、正十六烷酸甲酯、正十六烷酸异丙酯、亚油酸甲酯、反-油酸甲酯、顺-油酸甲酯及正十八烷酸甲酯8种脂类化合物。二甲基二硫醚是一种有机硫化合物，有恶臭，不溶于水，易溶于乙醇、乙醚和烃类，易分解，毒性较低[22]。而对照组大鲵黏液乙醇脱毒全粉溶液中的挥发性成分除8种脂类化合物，未检测出二甲基二硫醚。

3 结论与讨论

安全性评价是食品开发利用的前提条件，而急毒性实验是安全性评价的重要指标。本文利用大鲵黏液对小鼠经口灌胃，对黏液的急毒性进行安全性评价。实验测得大鲵黏液全粉LD50值约为4.64 g/kg，为毒性3级[24]，具有低毒性，经乙醇脱毒处理后，黏液无毒性，因此，推断大鲵黏液中毒性成分经乙醇脱毒后而去除。将乙醇脱毒上清液经气质联用色谱分析表明，臭味气体成分为二甲基二硫醚，具有低毒性、易溶于乙醇、易分解的性质，符合大鲵黏液低毒性的测定，从而证明大鲵皮肤黏液中的毒性成分为二甲基二硫醚。

通过对大鲵皮肤黏液的抗氧化性和急毒性的安全性评价结果表明，大鲵皮肤黏液具有抗氧化性和低毒性，经乙醇脱毒后可作为抗衰老的保健产品进行开发。

[1] 侯进慧,朱必才,童玉玮,等.中国大鲵研究进展[J].四川动物,2004,23(3):262-266.

[2] 刘炯宇,江建平,谢锋,等.两栖动物皮肤结构及皮肤抗菌肽[J].动物学杂志,2004,39(1):112-116.

[3] IEDO R C,JARED C.Cutaneous granuIar glands and amphibian venoms[J].Comp Biochem Physiol,1995,111A(1):21-29.

[4] ZUG G R,VITT L J,CAIDWEII J P.Herpetology(second edition)[M].New York:Academic Press,2001.

[5] 肖冰,和七一,张康,等.两栖类动物皮肤分泌抗菌肽的研究进展[J].重庆师范大学学报:自然科学版,2012,29(2):24-29.

[6] ZINI C A,AUGUSTO F,CHRISTENSEN T E,et al.Monitoring biogenic volatile compounds emitted by Eucalyptus citriodora using SPME[J].Analytical Chemistry,2001,73(19):4729-4735.

[7] 张卓旻,朱丽,李攻科.生物“气味”研究进展[J].大学化学,2011,26(4):1-6.

[8] 王利锋,李学英,王大忠.大鲵皮肤分泌液中抗菌肽的鉴定及生物活性研究[J].中国生化药物杂志,2011,32(4):269-272.

[9] 金桥,魏芳,佟长青,等.大鲵糖肽组分的高效液相色谱分析及其抗氧化活性研究[J].北京农学院学报,2011(1):27-29.

[10] 曲敏.大鲵黏液低聚糖肽的制备、性质和生物活性及应用研究[D].沈阳:沈阳农业大学,2012.

[11] 曲敏,田丽冉,佟长青,等.大鲵低聚糖肽对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用[J].食品工业科技,2013,34(14):350-352.

[12] GUO W T,AO M Z,LI W,et al.Major biological activities of the skin secretion of the Chinese giant salamander,Andrias davidianus[J].Verlag der Zeitschrift für Naturforschung,2012,67(1):86-92.

[13] 程晓航,易华伟,白秀琴,等.动物黏液:屏障效应及黏附机制[J].科学通报,2012,57(22):2051-2057.

[14] 韩少华,朱靖博,王妍妍.邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J].中国酿造,2009(6):155-157.

[15] 玄红专,桑青,麻建军.邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究[J].食品科技,2008(4):137-139.

[16] NENADIS N,TSIMIDOU M.Observations on the estimation of scavenging activity of phenolic compounds using rapid 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) tests[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society,2002(9):1191-1195.

[17] OZECLIK B,LEE J H,MIN D B.Effects of light,oxygen,Ph on the absorbanc 2,2-dipheny-picrylhydrazyl[J].Food science,2003,68(2):487-490.

[18] 中华人民共和国卫生部.保健食品检验与评价技术规范实施手册[M].北京:清华同方电子出版社,2003.

[19] 高珊,童英,郑珊,等.4种急性经口毒性试验对3种化妆品原料的对比研究[J].毒理学杂志,2012,26(1):65-67.

[20] 刘佳.两种海洋节肢动物风味物质的分析与评价[J].食品科技,2008(2):98-100.

[21] 陈俊卿,王锡昌.固相微萃取与气质联用法分析鱼肉中气味成分[J].广州食品工业科技,2004,20(3):117-118.

[22] 曹国强,郑辉东.活性炭液相吸附脱除二甲基二硫醚[J].化工进展,2012,31(6):1357-1361.

[23] 廖展如,陈文学.邻苯三酚自氧化法适于测定SOD活性吗[J].华中师范大学学报:自然科学版,2003,37(1):59-64.

[24] 中华人民共和国国家标准.GB/T21757-2008.化学品急性经口毒性试验急性毒性分类法[S].北京:中国标准出版社,2008.

[责任编辑：魏 强]

Study on the toxicity and antioxidant activity of mucus powder from salamander skin

XU Wei-liang1，CHEN De-jing1,2， WEI Hong3， LIU Yu3

(1.School of Bioscience and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;2.Shaanxi Province Key Laboratory of Biological Resources, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, China;3.Department of Laboratory Animals, The Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)

The study focuses on antioxidant performance and safety evaluation of acute toxicity of salamander skin mucus. The study first uses pyrogallol autoxidation and DPPH method to determine salamander mucus to superoxide anion radical(O-·2) scavenging and DPPH radical scavenging. Then it experiments with giant salamander breeding mice fed to test acute toxicity of Andrias davidianus skin mucus and analyses toxic constituents of mucus temperament by using GC-MS chromatography. The results show that the clearance rate of Salamander mucus flour to superoxide anion radical and to DPPH radical scavenging is 6.77% and 90.25% respectively, and that LD50value ofAndriasmucus powder is 4.64 g/kg and toxic ingredient is imethyl disulfide (C2H6S2). It concludes thatAndriasmucus is antioxidant and low in toxicity, and that it can be developed for health care products after detoxification.

giant salamander; skin mucus; toxicity; antioxidant

1673-2944(2015)02-0056-06

2014-12-10

陕西省中小企业科技创新项目(2014CXZJ36)；陕西理工学院研究生创新基金资助项目(SLGYCX1311)

徐伟良(1988—)，男，内蒙古锡盟正蓝旗人，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为应用生物化学；[通信作者]陈德经(1961—)，男，陕西省西乡县人，陕西理工学院副教授，硕士生导师，主要研究方向为食品生物技术；魏泓(1963—)，男，四川省泸州市人，第三军医大学教授，博士生导师，主要研究方向为动物分子遗传学。

Q592; S917.4

A