郭庆栋 李慎涛 张玉祥 贾弘褆△

（1.首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系；2.首都医科大学基础医学院免疫学系 北京，100069）

在生物体内，糖基转移酶催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能［1］。T4噬菌体β葡糖基转移酶能特异性地将尿嘧啶二磷酸葡萄糖（UDP－Glc）的葡萄糖单元转移至双链DNA的5－羟甲基胞嘧啶残基上，形成β－葡萄糖基－5－羟甲基胞嘧啶［2］。T4噬菌体β葡萄糖转移酶可通过克隆T4噬菌体β－GT基因的重组大肠杆菌获得。T4噬菌体β葡糖基转移酶对5－hmC残基的定向修饰来区分5－mC和5－hmC。这种酶可以将所有5－hmC糖基化，产生5－ghmC。这个反应是序列无关的，因此所有5－hmC都将糖基化，而C或5－mC则不受影响［3］。

1 材料与方法

1.1 主要材料 T4噬菌体购于美国ATCC，大肠杆菌DH5α感受态细胞，pMD－18T载体、qPCR试剂 盒 购 于 Transgene 公 司，pGEX－6P－1 质 粒 和BL21（DE3）感受态细胞均为首都医科大学基础医学院免疫学系李慎涛老师提供；质粒小提试剂盒购自Omega公司；核酸纯化试剂盒购自MN公司；氨苄青霉素购自Sigma公司；限制性内切酶（BamH I、Xho I）购自 NEB公司，T4DNA聚合酶、连接酶、Ex Taq酶均购自 TAKARA 公司；Glutathione Sepharose－4B层析柱购自GE公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体β－GT基因的PCR扩增 从NCBI数据库获得噬菌体β－GT蛋白的基因序列，该序列的长度为1056bp，编码392个氨基酸，并组装修饰形成β－GT蛋白。根据β－GT蛋白基因的编码序列，设计了上下游引物，由北京生工公司合成：上游引物： 5’－ATCGGGATCCAAAATTGCTATAATTAATATG－3’；下游引物：5’－AAGGCTCGAGTTATAAATCAATAGCTTTTTTGAACGCATC－3’；在上下游引物的5’端分别引入BamH I和Xho I酶切位点，利用饱和酚、氯仿、异戊醇进行噬菌体基因组DNA的提取和纯化，用适量TE缓冲液将其溶解待用。……