陈丽君等

[摘要] 目的 探讨汉黄芩素对人卵巢癌HO-8910细胞增殖、凋亡的影响，并分析可能的作用机制。 方法 采用不同浓度（0、20、50、80、100、130 μg/mL）的汉黄芩素处理人卵巢癌HO-8910细胞，48 h后分别用MTT法检测细胞活力的变化，Annexin Ⅴ/PI双染法检测细胞凋亡的变化，Western blotting分析p21、cyclin B1、p53和Bax蛋白的表达水平。 结果 随着处理浓度的增加，汉黄芩素剂量依赖性地抑制人卵巢癌HO-8910细胞的增殖（P < 0.05），同时诱导细胞大量凋亡。进一步分析证实，汉黄芩素能够剂量依赖性地下调细胞周期相关蛋白cyclin B1的表达，同时上调p21的表达（P < 0.05），提示汉黄芩素可通过抑制细胞有丝分裂进程来抑制细胞的增殖。此外，汉黄芩素还能显著诱导p53通路的活化及其下游促凋亡分子Bax的表达（P < 0.05）；而用p53通路抑制剂PFT-α预处理能够显著性降低汉黄芩素诱导的促卵巢癌细胞的凋亡效应（P < 0.05）。 结论 汉黄芩素能通过抑制细胞有丝分裂进程及调控p53促凋亡通路的活化来抑制卵巢癌细胞的增殖，同时显著诱导细胞大量凋亡，提示汉黄芩素可能具有一定的抗卵巢癌活性，从而为进一步探讨其作为临床治疗卵巢癌的潜在药物奠定理论基础。

[关键词] 卵巢癌；汉黄芩素；增殖；凋亡；细胞周期

[中图分类号] R737.31 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）02（b）-0004-05

[Abstract] Objective To explore the role and underlying molecular mechanism of wogonin on the proliferation and apoptosis of ovarian carcinoma HO-8910 cells. Methods Following the stimulation with various doses of wogonin （0， 20， 50， 80， 100， 130 μg/mL） for 48 h， MTT colorimetry was used to detect cell proliferation rate. Cell apoptosis was analyzed using double staining with Annexin Ⅴ and propidium iodide （Annexin Ⅴ/PI）. The expression levels of p21， cyclin B1， p53 and Bax were assessed by Western blotting. Results Wogonin dampened ovarian carcinoma HO-8910 cell proliferation and promoted the apoptosis rates in a dose-dependent manner （P < 0.05）. Moreover， wogonin dose-dependently down-regulated the expression levels of cell cycle protein cyclin B1， as well as the up-regulation of p21 expression levels （P < 0.05）， suggesting that wogonin might inhibit cell growth by suppressing cell cycle. Additionally， an obvious increase in p53 and its downstream Bax was observed in HO-8910 cell stimulated with wogonin statistically （P < 0.05）. However， this up-regulation was dramatically attenuated when preconditioning with p53 inhibitor PFT-α （P < 0.05）. Conclusion Wogonin can abrogate HO-8910 cell proliferation and enhance cell apoptosis by regulating cell mitosis and apoptosis-related p53 pathway， implying as potential suppressor for ovarian cancer. Therefore， this study will support its potential targets for further development of anti-ovarian cancer therapy.

[Key words] Ovarian cancer； Leptin； Proliferation； Apoptosis； Cell cycle

汉黄芩素（wogonin，别名5，7-二羟基-8-甲氧基-2-苯基-4H-1-苯并呋喃-4-酮）是从中药黄芩根及半枝莲中提取的活性物质，具有抗病毒、抗菌、保护血管、降血脂及利胆、解痉等生物活性[1-4]。近年来，汉黄芩素在抗肿瘤中的作用得到广泛关注。研究表明，汉黄芩素能够有效地抑制多种癌细胞的生长，同时诱导肿瘤细胞的大量凋亡[4-5]。但是，汉黄芩素对卵巢癌细胞的影响及其机制尚不清楚。因此，本研究体外观察汉黄芩素对卵巢癌细胞HO-891增殖及凋亡的影响，并探讨相关的作用机制，从而为进一步探讨其在临床中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人卵巢癌HO-8910细胞株购自南京凯基生物科技发展有限公司；胎牛血清和MTT购自华美生物工程有限公司；p53抑制剂PFT-α购自Calbiochem公司；Annexin Ⅴ/PI双染凋亡检测试剂盒购自BD公司；兔抗人p53、p21和Bax多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；兔抗人cyclin B1抗体和小鼠抗兔-HRP标记抗体均购自Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与处理 将人卵巢癌HO-8910细胞株置于含10%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2孵箱中培养。每1～2天换液1次，2～3 d传代1次。将对数生长期的HO-8910细胞接种于24孔板，每孔200 μL，含1×105个细胞。细胞中分别加入20、50、80、100、130 μg/mL的汉黄芩素，培养48 h后进行相关实验，空白处理为空白对照组。用100 μg/mL的汉黄芩素处理细胞，48 h后用25 μmol/L的p53抑制剂PFT-α处理细胞，2 h后进行细胞凋亡实验。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖能力 不同浓度汉黄芩素处理细胞48 h后，向每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），继续培养4 h后弃上清；加入150 μL DMSO（二甲基亚砜），置于摇床上低速振荡10 min，充分溶解结晶物；酶标仪上测定490 nm处OD值。细胞存活率=（实验组A490值-空白调零组A490值）/（空白对照组A490值-空白调零组A450值）×100%

1.2.3 Annexin Ⅴ/PI检测细胞凋亡 收集预处理细胞，用预冷的PBS洗涤3次后加入1 mL 1×Annexin Ⅴ结合缓冲液，4℃ 1000 r/min离心10 min去上清；加入200 μL结合缓冲液重悬细胞，随后分别加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI（5 μg/mL）进行标记，轻轻混匀；避光孵育30 min，将细胞置于流式细胞仪中检测细胞凋亡情况。具体操作按说明书进行。

1.2.4 Western blotting检测蛋白表达 用0.05%胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤3次；200 μL预冷的裂解液裂解细胞，冰上放置20 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清。样品煮沸处理后，进行SDS-PAGE蛋白电泳；采用半干转法将目的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉封闭，按照常规的方法加入兔抗人p21、cyclin B1、p53及Bax一抗和HRP标记的小鼠抗兔的二抗。ECL底物显色，观察p21、cyclin B1、p53及Bax的表达水平。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 汉黄芩素对HO-8910细胞增殖的影响

MTT法分析显示，与空白对照组相比，汉黄芩素对卵巢癌细胞HO-8910的生长具有抑制作用，且随着剂量的加大，细胞的生长速率明显降低，其中，80、100、130 μg/mL汉黄芩素作用48 h时，细胞的存活率分别为（61.4±4.2）%、（55.8±5.8）%、（42.7±6.7）%，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 汉黄芩素对HO-8910细胞凋亡的影响

流式分析显示，与空白对照组相比，汉黄芩素处理组中Q2和Q4区荧光强度不断增加，表明汉黄芩素能够诱导HO-8910细胞大量凋亡（图2A）。定量分析表明，用50、100 μg/mL汉黄芩素处理后，细胞的凋亡率分别为（27.2±2.5）%和（45.1±3.8）%，与空白对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）（图2B），提示汉黄芩素剂量依赖性地诱导HO-8910细胞的凋亡。

2.3 汉黄芩素对HO-8910细胞周期蛋白cyclin B1和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21表达的影响

Western blotting分析表明，与空白对照组相比，汉黄芩素剂量依赖性地上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21的表达，同时细胞周期蛋白cyclin B1的表达明显下调（图3A）。定量分析证实，分别用50 μg/mL和100 μg/mL汉黄芩素处理48 h后，p21的表达水平分别上调至空白对照组的2.50倍和3.82倍（P < 0.01）；而cyclin B1的表达水平分别下降至空白对照组的0.78倍和0.52倍（P < 0.05）（图3B），表明汉黄芩素可剂量依赖性地抑制HO-8910细胞DNA的合成。

3 讨论

卵巢癌是一种致死率最高的常见恶性妇科肿瘤，具有较高的增殖及迁移速率[6-8]。传统的手术、化疗、放疗及综合治疗等方法虽然在卵巢癌患者的治疗中得到广泛应用，但并不能提高晚期卵巢癌患者预后5年生存率，且伴随有化疗耐药及严重的药物毒副作用等缺点[9]。因此，寻求新型高效、低毒抗癌药物成为卵巢癌治疗研究的热点之一。

黄酮类化合物具有广泛的抗炎、抗病毒、解热等功效，越来越多的研究证实，黄酮类化合物具有潜在的抗肿瘤特性[10-12]。汉黄芩素是一种典型的黄酮类化合物，具有来源广泛、价格低廉、无毒副作用等优点，可发挥抗感染、抗血栓和抑制肿瘤等功能[13-15]。研究证实，汉黄芩素不仅能够制黑素瘤细胞的侵袭，还可通过调控多种信号通路发挥抗肺癌细胞生长的功效[5，16]。但是，汉黄芩素对卵巢癌细胞生理特性的影响及其机制尚不清楚。

本研究证实，汉黄芩素可剂量依赖性地抑制卵巢癌细胞增殖，同时诱导细胞大量凋亡。多项研究证实，许多抗癌药可通过阻断癌细胞的细胞周期来抑制细胞的增殖进程，进而发挥细胞生长抑制效应[17-20]。已知细胞周期蛋白依赖性激酶CDK能够调控DNA的复制及有丝分裂过程，而p21作为CDK1的抑制剂，能够阻止细胞向G2/M期的过渡，抑制DNA合成。细胞周期蛋白cyclin B1能够与CDK1结合，触发细胞有丝分裂进程。当用汉黄芩素处理后，细胞中p21的表达水平显著性增加，同时cyclin B1表达水平明显下降，表明汉黄芩素能够通过阻断细胞有丝分裂进程来抑制卵巢癌细胞的增殖。已知p53及其下游的促凋亡分子Bax在调控细胞凋亡的过程中起着重要作用。本研究证实，汉黄芩素处理后，卵巢癌细胞HO-8910中p53的表达水平明显增高，同时诱导p53下游促凋亡分子Bax表达的上调。进一步分析表明，阻断p53通路后，汉黄芩素诱导的卵巢癌细胞凋亡率明显下降，提示汉黄芩素可能通过p53通路的活化来诱导细胞凋亡。因此，本研究证实了汉黄芩素能够通过抑制细胞周期进程及促凋亡通路的活化来调节卵巢癌细胞的增殖和凋亡，从而为进一步讨论其在卵巢癌治疗中的应用奠定理论基础。但是，汉黄芩素如何调控细胞周期及活化p53促凋亡通路的作用机制尚不清楚，还有待于进一步研究。

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（收稿日期：2014-11-05 本文编辑：程 铭）