王春英刘平崔忠涛冯淼徐平

1哈尔滨医科大学附属第四医院耳鼻咽喉科(哈尔滨　150001) ; 2黑龙江省医院

黑龙江省部分地区非综合征型聋患者GJB2、SLC26A4和线粒体DNA 12S rRNA基因检测结果分析△

王春英1刘平2崔忠涛1冯淼1徐平1

1哈尔滨医科大学附属第四医院耳鼻咽喉科(哈尔滨150001) ; 2黑龙江省医院

【摘要】目的调查黑龙江省非综合征型聋(NSHL)患者三种常见聋病易感基因的突变特征。方法对380 例NSHL患者(患者组)和202例听力正常人(对照组)，采集静脉血DNA，用PCR方法检测GJB2、SLC26A4 2168和IVS7-2 A＞G位点以及线粒体DNA 12S rRNA基因突变情况。结果所有受试者中共检测出5种GJB2致病突变和2种SLC 26A4致病突变。患者组中，76例(20.01%)患者携带杂合或纯合GJB2 235 del C突变，突变率最高，其次为c.299-300 del AT，占7.37%(28/380)。SLC26A4基因2168和IVS7-2 A＞G杂合或纯合突变者分别为14例和27例，包括正常对照组SLC26A4 IVS7-2 A＞G杂合突变4例;患者组中3例为SLC26A4 2168和SLC26A4 IVS7-2复合杂合突变。检测出1例NSHL患者线粒体12S rRNAm.1555A＞G纯合突变。结论GJB2 c.235 del C 和SLC26A4 IVS7-2 A＞G是黑龙江省部分地区的高发致病基因突变。

【关键词】NSHL; GJB2; SLC26A4; 12S rRNA

△黑龙江省自然科学基金项目(D201068)资助

研究显示，50%～70%的听力障碍与遗传因素有关［1，2］，其中，70%的遗传性聋属于非综合征型听力损失。目前，已知有很多基因都与非综合征型聋有关，一个或几个基因存在突变，或一个基因中的不同位点存在突变，都会引起耳聋。在不同种族，甚至同一种族不同地区的人群中，耳聋基因及其突变位点不尽相同。GJB2、SLC26A4、线粒体基因(A1555G 和C1494T突变)是导致中国大部分遗传性聋的三个最常见基因。因此，为了调查黑龙江省部分地区聋病易感基因突变的情况，近年来对该地区非综合征型聋患者上述三种耳聋易感基因的突变情况进行了检测，希望为本地区的防聋治聋工作提供流行病学资料。

1　资料与方法

1.1研究对象收集来自黑龙江省哈尔滨市、齐齐哈尔市、牡丹江市、绥化地区及佳木斯市2011年9月来哈尔滨医科大学附属医院接受义诊及2011年9月至2013年10月到门诊就诊的散发病例中诊断为非综合征型聋的患者共380例(患者组)，男181例，女199例，均为汉族;年龄0.5～38岁，平均10.5 ±10.9岁;其中277例为语前聋或先天性聋，且程度在中、重度聋及以上。同时随机收集听力正常且无耳聋家族史的202人作为正常对照组。

1.2病史及标本采集采用问卷调查形式，调查表内容涉及患者基本信息及耳聋史、家族史、高危因素等，并由患者或其监护人填写。本研究获得哈尔滨医科大学附属第四医院道德伦理委员会批准，对所有研究对象的临床信息和血样采集，均获得了患者本人或其监护人的同意，并签署了知情同意书。

1.3听力学检查对所有受试者进行听力学检查，包括纯音测听、声导抗、ABR、瞬态诱发耳声发射。耳聋分级以WHO 1997年听力障碍分级为标准［3］，即听阈在26～40 dB HL为轻度聋; 41～60 dB HL为中度聋; 61～80 dB HL为重度聋;大于81 dB HL为极重度聋。

1.4GJB2、SLC26A4和线粒体12S rRNA基因的突变检测对380例NSHL患者和202例正常对照组进行GJB2、SLC26A4基因2168和IVS7-2 A＞G位点和线粒体12S rRNA基因的突变分析。提取静脉全血DNA(天根生化科技，中国北京)，随后进行PCR。引物序列见表1。扩增条件为95℃3分钟，95℃30秒、59℃30秒、72℃1分钟4个循环，95 ℃30秒、56℃30秒、72℃1分钟29个循环，最后72℃延伸7分钟。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，随后进行纯化(天根生化科技，中国北京)，最后通过GenomeLab GeXP多功能遗传分析系统(Beckman，USA)进行测序。

表1　GJB2、SLC26A4和线粒体12S rRNA基因所在区段引物序列

2　结果

各基因检出突变位点见表2。

2.1GJB2基因突变检测结果在380例患者和202例正常对照组中共检测到7种GJB2基因突变，其中5种为致病性突变。在380例耳聋患者中，c.235 del C是最常见的突变类型，约占20.0% (76/380)，其次为c.299-300 del AT，约占7.37% (28/380)。对照组只有2例检测到c.235 del C杂合突变，2例c.109 G＞A杂合突变(表3)。380例患者中，检测到1例c.35 del G和c.235 del C GJB2复合杂合突变，4例c.235 del C和c.299-300 del AT复合杂合突变，1例c.176 del 16和c.299-300 del AT复合杂合突变，1例c.35 del G、c.176 del 16和c.235 del c复合杂合突变，这些患者均表现为极重度聋。

2.2SLC26A4基因突变检测结果本研究分别检测出14例SLC26A4 2168突变和27例SLC26A4 IVS7-2突变(其中3例同时检出这两种突变)，其中包括正常对照组中的4例SLC26A4杂合突变。患者组中3例(ID4，ID26，ID125)检测出SLC26A4 2168和SLC26A4 IVS7-2复合杂合突变的患者均表现为极重度聋，且伴有前庭水管扩大(已由MRI证实) ;追踪家族史，其中一例患者(ID4)的父母分别为SLC26A4 2168杂合突变和SLC26A4 IVS7-2杂合突变，听力检测正常;一例患者(ID125)的父亲为SLC26A4 2168杂合突变，祖父未检出SLC26A4 2168突变和SLC26A4 IVS7-2突变，祖母为SLC26A4 IVS7-2杂合突变，这三位家属听力均正常;上述2例患者的家属均未纳入到正常对照组中。本研究中34例携带SLC26A4 2168突变和/或SLC26A4 IVS7-2突变的患者中，21例接受了影像学检查，均证实为大前庭水管综合征。

2.3线粒体DNA 12S rRNA基因突变检测结果380例患者和202例正常对照组中仅患者组有1例10岁男孩检测出m.1555A＞G纯合突变，未检测到m.1494C＞T突变。本研究中，有2例患者同时携带GJB2和SLC26A4突变，其中1例(ID79)同时伴有GJB2 235纯合突变和SLC26A4 IVS7-2杂合突变，另一例(ID227)为同时伴有GJB2 235杂合突变和SLC26A4 IVS7-2杂合突变，且两者均表现均为极重度聋。遗憾的是，本研究没有获得这2例患者家属的相关信息。

表2　所有受试者检出突变位点类型及基因定位

表3　所有受试者不同基因定位GJB2基因突变检出情况(例)

3　讨论

研究显示，GJB2c.235del C是大多数亚洲人最常见的突变类型［4，5］。本组380例NSHL患者和202例正常对照组中，共检测到7种GJB2突变，其中c.235 del C是最常见的耳聋相关性突变，约占20%，略高于我国以往其他的报道［4，6，7］。患者组中10例(10/380，2.6%)检测到GJB2 109 G＞A，对照组未检测到该突变，以往Chen［6］的研究认为该位点为基因多态性，而Wei［5］的研究认为该突变为致病性突变，本研究倾向于后者。Cryns等［8］认为GJB2突变的基因型在耳聋的程度上扮演着十分重要的角色; Huang［9］的研究显示，在GJB2、SLC26A4或线粒体基因突变患者中，GJB2基因突变致聋的患者听力水平最差。本研究中检测到的7例GJB2复合突变的患者均表现为先天性重度聋，充分说明了这一点。胡华梅等［10］曾报道GJB2基因突变具有较高的携带率，若夫妻双方都为该基因的杂合突变时，建议行耳聋基因产前筛查，可以有效地避免耳聋患儿的出生。

本研究中，34例患者携带有SLC 26A4基因突变，正常对照组中检测出4例携带SLC26A4杂合突变。其中患者组中的两例患者家属分别为SLC26A4 IVS7-2或SLC26A4 2168位点的杂合突变，且听力正常，而这2例患者均为两种突变的复合杂合型突变，表现为极重度聋，说明对于正常人群耳聋基因的筛查也很重要。此外，携带SLC26A4基因突变的患者极有可能为大前庭水管综合征(EVA)，为了明确诊断，应尽快进行影像学检查。本研究中的34例患者中有21例进行了影像学检查，经证实均为大前庭水管综合征。此类患者应避免剧烈运动、外伤以及碰撞等可能导致听力恶化因素［11］。

约20%的语后聋可能是由于线粒体基因突变所引起的，但可能存在种族差异［12］。本研究中，仅患者组有1例(0.17%，1/582) 10岁的男孩检测到m.1555A＞G纯合突变，未检测到m.1494C＞T和新的突变，结果远远低于Guo等［13］报道的51.11%，同时也低于Yang等关于我国西北地区的报道［14］。这可能与本研究的患者组大部分为先天性聋或语前聋有关。

耳聋病因复杂，与之相关的基因也较多，故明确该病的致病机理是一项长期而艰巨的任务，由于其具有地区和种族的差异性，需要较多的研究人员投入到该项工作中来，为优生优育以及预防耳聋的发生提供宝贵资料。本研究结果显示: GJB2 c.235 del C和SLC26A4 IVS7-2 A＞G是黑龙江省部分地区的高发致病突变位点，这一结论与之前的文献报道相一致，本研究结果为黑龙江地区的耳聋预防奠定了一定的基础，丰富了耳聋基因突变数据库，同时可为今后临床医师诊断、治疗及遗传咨询提供参考。

4参考文献

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8 Cryns K，Orzan E，Murgia A，et al.A genotype-phenotype correlation for GJB2 (connexin 26) deafness［J］.Med Genet，2004，41: 147.

9 Huang SS，Wang GJ，Jian Y，et al.Phenotype and genotype of deaf patients with combined genomic and mitochondrial inheritance models［J］.Mitochondrion，2013，13: 791.

10胡华梅，胡华，董艳玲，等.新生儿中常见的9个耳聋基因突变位点筛查分析［J］.第三军医大学学报，2012，34: 96.

11 Scott DA，Wang R，Kreman TM，et al.The Pendred syndrome gene encodes a chloride-iodide transport protein［J］.Nature Genet，1999，21 : 440.

12 Estivill X，Govea N，Barcelo E，et al.Familial progressive sensorineural deafness is mainly due to the mtDNA A1555G mutation and is enhanced by reatment of aminoglycosides［J］.Am Hum Genet，1998，62: 27.

13 Guo YF，Liu XW，Guan J，et al.GJB2，SLC26A4 and mitochondrial DNA A1555G mutations in prelingual deafness in Northern Chinese subjects［J］.Acta Oto-Laryngol，2008，128: 297.

14 Yang XL，Cheng XB，Chen XJ，et al.Common molecular etiology of patients with nonsyndromic hearing loss in Tibetan，Tu nationality，and Mongolian patients in the northwest of China［J］.Acta Oto-Laryngologica，2013，133: 930.

(2014-09-09收稿)

(本文编辑李翠娥)

·研究报告·

通讯作者:徐平(Email: panjing_1981@126.com)

【中图分类号】R764.43

【文献标识码】A

【文章编号】1006-7299(2015) 06-0651-03

DOI:10.3969/j.issn.1006-7299.2015.06.020

网络出版时间:2015-9-10 16: 47

网络出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/42.1391.R.20150910.1647.026.html