宋 芳 冯若鹏 赵紫薇 陈 晶 贺 帅 陈小艳

1.包头医学院组织学与胚胎学教研室（014010）；2.包头医学院形态学实验室

妊娠期母体产生大量的雌激素、孕激素等，它们能抑制辅助性T细胞（Th）1亚群反应，促进Th2细胞亚群 反 应［1－2］。Fotiadou 等［3］和 Piccinni等［4］发现孕酮可以促进Th2型细胞亚群分泌的细胞因子，如白介素（IL）－4和IL－5的高水平表达，参与免疫调节，减少流产发生。因此，有望通过调整孕酮水平对Th1／Th2型细胞因子间的平衡进行调节，有效地降低流产率。IL－8为Th1型细胞因子，表现为免疫杀伤作用，可引发自然流产，本实验通过比较孕酮干预的 CBA／J×DBA／2 小鼠流产模型和 CBA／J×BALB／c小鼠正常妊娠模型IL－8及其mRNA的变化，探讨孕酮对自然流产小鼠IL－8的调节作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

兔抗人IL－8多克隆抗体为Santa Cruz公司产品；孕酮和IL－8酶联免疫吸附测定（ELISA）检测试剂盒、PV－6001试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司；RNA抽提试剂RNArose Reagent购于上海华舜生物工程有限公司；通用逆转录多聚酶链反应（RT－PCR）试剂盒购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

1.2 建立小鼠自然流产模型

将雌性CBA／J小鼠分别与雄性DBA／2或BALB／c小鼠合笼交配，次日晨检出阴栓者记为妊娠1d，分别建立自然流产模型与正常妊娠模型。于妊娠14d处死孕鼠，计算胚胎吸收率（R），以评价模型成功与否。R＝Re／（Re＋F）（Re为吸收胚胎数，F为存活胚胎数）。

1.3 实验分组

将自然流产小鼠分为两组：孕酮组和模型组，孕酮组于妊娠5d腹腔注射黄体酮溶液（2mg／kg），每日1次，维持至妊娠14d；模型组同步注射等量的生理盐水；正常妊娠小鼠不做任何处理。每组10只小鼠。

1.4 ELISA 检 测

3组孕鼠均于妊娠14d采用眼球摘除术收集血样，2000rpm／min离心10min，取血清，用 ELISA试剂盒检测孕酮及IL－8水平。以标准品2500、1250、625、312.5、156.25、78.125、39.06、0pg／ml所对应的浓度作为纵坐标，OD值作为横坐标在半对数纸上作图，画出标准曲线。所有OD值均减去空白管值后再计算。根据样品OD值在该标准曲线图上查出相应样品中孕酮、IL－8的含量。

1.5 免疫组织化学染色

将符合实验条件的各组小鼠绒毛、蜕膜组织制备成石蜡切片，常规脱蜡至水；0.3%H2O2·甲醇室温孵育30min，封闭内源性过氧化物酶；滴加兔抗人IL－8抗体工作液（1∶200），4℃过夜；滴加羊抗兔IgG抗体－辣根过氧化物酶（HRP）多聚体，室温孵育30min。二氨基联苯胺（DAB）－H2O2室温显色，Mayer苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片。阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。用捷达801图像分析系统分别测定各组绒毛、蜕膜组织IL－8蛋白表达的相对含量。

1.6 RT－PCR

各组小鼠绒毛、蜕膜组织，生理盐水洗净后分别投入液氮到组织硬化，然后冻存于－80℃冰箱，以供提取RNA用。按通用RT－PCR试剂盒所示步骤，将mRNA反转录为cDNA，用所得cDNA进行PCR反应，PCR产物在2.0%琼脂糖凝胶上电泳，采用JeDa 801凝胶成像分析系统对DNA条带进行灰度扫描。

将同一标本IL－8DNA条带的灰度值／β-actin DNA条带的灰度值＝IL－8mRNA的相对含量

IL－8引物序列：上游引物5＇－GACAAGAGCCAGGAAGAAAC－3＇，下游引物5＇－CTACAACAGACCCACACAATAC－3＇，扩增片段长度459bp；βactin引物序列：上游引物5＇－CGGGAAATCGTGCGTGACAT－3＇，下游引物5＇－GAACTTTGGGGGATGCTCGC－3＇，扩增片段长度712bp。

1.7 统计学处理

所有数据采用SPSS 11.5软件分析处理，用均值±标准差（）表示，经方差齐性检验后，用单因素方差分析（one－way ANOVA）中的LSD法处理，并进行组间两两比较，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA 检 测

孕酮组血清孕酮水平高于模型组，而IL－8水平低于模型组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。孕酮组血清孕酮、IL－8水平与正常组比较均无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 各组血清孕酮、IL－8水平比较（）

表1 各组血清孕酮、IL－8水平比较（）

＊与孕酮组比较P＜0.01

组别 孕酮（ng／ml） IL－8（pg／ml）孕酮组 84.91±10.05 615.23±213.62模型组 41.83±9.77＊ 1653.14±321.25＊正常组 91.27±10.91 653.87±183.43

2.2 免疫组织化学染色

在绒毛和蜕膜组织中，各组IL－8的蛋白表达主要定位在绒毛上皮细胞、蜕膜细胞及腺上皮细胞的细胞质内，呈棕黄色颗粒，阳性反应强弱不等（图1）。

图1 IL－8蛋白在各组绒毛和蜕膜组织中的表达（HRP，200×）

图像分析结果显示：孕酮组IL－8的蛋白相对含量在绒毛组织、蜕膜组织的蜕膜细胞和腺上皮细胞中均低于模型组，差异有统计学意义（P均＜0.05），与正常组比较均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 各组IL－8在绒毛、蜕膜组织中的蛋白相对含量比较（）

表2 各组IL－8在绒毛、蜕膜组织中的蛋白相对含量比较（）

与孕酮组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

组别 绒毛上皮 蜕膜蜕膜细胞 腺上皮孕 酮 组 0.067±0.028 0.094±0.025 0.104±0.021模型 组 0.135±0.012＊＊ 0.107±0.024＊ 0.116±0.019＊正常 组 0.059±0.021＃ 0.088±0.022＃ 0.110±0.017＃

2.3 RT－PCR实验

2.3.1 扩增产物的定性分析 IL－8mRNA在各组绒毛、蜕膜组织中均有表达，IL－8和β-actin的RTPCR产物与理论长度一致见图2。

图2 IL－8mRNA在各组绒毛、蜕膜组织表达的RT－PCR分析

2.3.2 扩增产物的半定量分析 在绒毛组织和蜕膜组织中，孕酮组IL－8mRNA的表达均低于模型组，差异有统计学意义（P均＜0.01），与正常组比较无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 各组IL－8mRNA在绒毛、蜕膜组织相对含量比较（）

表3 各组IL－8mRNA在绒毛、蜕膜组织相对含量比较（）

与孕酮组比较＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01 ＃P＞0.05

组别 绒毛组织 蜕膜组织孕酮组 61.28±4.13 72.14±3.04模型组 85.72±2.63＊＊ 82.23±4.11＊正常组 58.33±2.87＃ 70.55±3.66＃

3 讨论

目前，不明原因的自然流产已被公认为与机体的免疫因素有关，且Th1／Th2细胞因子平衡对正常妊娠是十分重要的。正常妊娠是以Th2型细胞因子为主的生理现象，当发生向Th1型细胞因子的偏离时，可能会导致自然流产［5－7］。IL是由多种细胞分泌的在免疫调节过程中起重要作用的细胞因子，国内外已有学者研究了自然流产患者血清或组织中IL－2、IL－4、IL－5、IL－6、IL－8、IL－10等的变化，但关于IL－8与自然流产的相关性研究的文献报道较少，Madhappan等［8］、Koumantaki等［9］以 及 国 内 学 者齐卫红［10］和黄江宁等［11］均是采用ELISA法检测反复自然流产患者血清IL－8的含量，且得出结论不一致。我们在前期工作中采用RT－PCR、Western blot和免疫组织化学染色技术在自然流产母胎界面进行研究，发现并报道：反复自然流产患者绒毛、蜕膜组织中IL－8mRNA和蛋白表达水平明显高于正常妊娠妇女，提示IL－8参与反复自然流产的病理过程。然而引发自然流产的免疫机制相当复杂，Th1／Th2型细胞因子间的平衡受多种因素的调控，如何调节正常的免疫平衡，维持正常妊娠的进行，减少流产的发生是关键，因此，有必要进一步研究引发自然流产的调节机制。

众所周知，蜕膜的正常生长和发育对妊娠的维持起着相当重要的作用，而孕酮是维持早孕期蜕膜正常形态和功能的必要激素。由于临床研究受到患者遗传背景、生活习惯、工作环境等诸多复杂因素的影响，而采用近交系小鼠可以排除混杂因素，CBA／J和DBA／2是较为常用的近交品系小鼠。CBA／J×DBA／2小鼠具有反复自然流产的特点，胚胎吸收率恒定于30%～45%，而CBA／J×BALB／c小鼠的胚胎吸收率仅为5%～10%。目前普遍认为，免疫因素是这一动物模型发生自然流产的主要原因，因此它们是用于研究母胎免疫调节机制较为理想的动物模型［12－13］。

ELISA实验结果表明：外源性给予黄体酮的自然流产小鼠，其血清孕酮水平明显升高，而IL－8水平明显降低，且血清孕酮、IL－8水平与正常组比较差异均无统计学意义。由此可见，孕酮对IL－8产生抑制作用，从而减少中性粒细胞侵入蜕膜组织，可以保证妊娠的顺利进行。同时，免疫组化染色和RTPCR结果显示：在绒毛组织中，外源性给予黄体酮的自然流产小鼠IL－8的蛋白和mRNA相对含量明显降低，与正常孕鼠比较无显著性差异；在蜕膜组织中，外源性给予黄体酮的自然流产小鼠IL－8蛋白和mRNA相对含量也降低，并接近正常孕鼠的水平。

因此推测，孕酮通过下调IL－8表达来减少自然流产的发生和发展，此研究可为防治反复自然流产提供一定的理论依据。

［1］ Sereshki N，Gharagozloo M，Ostadi V，et al.Variations in T－helper 17and Regulatory T Cells during The Menstrual Cycle in Peripheral Blood of Women with Recurrent Spontaneous A－bortion［J］.Int J Fertil Steril，2014，8（1）：59－66.

［2］ 廖义鸿，李红发.孕酮调节复发性流产患者淋巴细胞产生Th1、Th2因子及机制［J］.中国优生与遗传杂志，2009，17（11）47－48.

［3］ Fotiadou C，LazaridouE，Sotiriou E，et al.Spontaneous abortion during ustekinumab therapy［J］.J Dermatol Case Rep，2012，6（4）：105－107.

［4］ Piccinni MP，Maggi E，Romagnani S.Role of hormone－controlled T－cell cytokines in the maintenance of pregnancy［J］.Biochem Soc Trans，2000 ，28（2）：212－215.

［5］ Wang Y，Xu B，Li M，et al.IL－22secreted by decidual stromal cells and NK cells promotes the survival of human trophoblasts［J］.Int J Clin Exp Pathol，2013，6（9）：1781－1790.

［6］ Liu F，Luo SP.Effect of Chinese herbal treatment on Th1－and Th2－type cytokines，progesterone and beta－human chorionic gonadotropin in early pregnant women of threatened abortion［J］.Chin J Integr Med，2009 ，15（5）：353－358.

［7］ 郭畅，韩宝生，陆冬梅，等.IL－2受体和IL－6在复发性自然流产患者胚胎组织中的表达［J］.中国妇幼保健，2009，24（27）：3873－3874.

［8］ Madhappan B，Kempuraj D，Christodoulou S，et al.High levels of intrauterine corticotropin－releasing hormone，urocortin，tryptase，and interleukin－8in spontaneous abortions［J］.Endocrinol，2003，144（6）：2285－90.

［9］ Koumantaki Y，Matalliotakis I，Sifakis S，et al.Detection of interleukin－6，interleukin－8，and interleukin－11in plasma from women with spontaneous abortion［J］.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2001，98（1）：66－71.

［10］ 齐卫红.反复自然流产患者外周血及母胎界面中白细胞介素10、8及肿瘤坏死因子-α的表达［J］.生殖医学杂志，2007，16（1）：52－53.

［11］ 黄江宁，赵期菊，刘琼芬，等.孕妇IL－8、IL－10血清学水平与早期自然流产的相关性研究［J］.中国优生与遗传杂志，2009，17（10）：76－77.

［12］ Clark DA，Chaouat G，Arck PC，et al.Cytokine－dependent abortion in CBA×DBA／2mice is mediated by the procoagulant fgl2prothrombinase［J］.J Immunol，1998，160（2）：545－549.

［13］ Jiang PJ，Zhao AM，Bao SM，et al.Expression of chemokine receptors CCR3，CCR5and CXCR3on CD4（＋）T cells in CBA／J×DBA／2mouse model，selectively induced by IL－4 and IL－10，regulates the embryo resorption rate［J］.Chin Med J.2009，122（16）：1917－1921.