穆峰 陈继冰 姜峰 汪媛 曾健滢 姚飞 牛立志 徐克成

·论著·

免疫磁珠联合定量PCR检测胰腺癌患者冷冻前后循环肿瘤细胞的变化

穆峰 陈继冰 姜峰 汪媛 曾健滢 姚飞 牛立志 徐克成

目的采用免疫磁珠(MACS)联合定量PCR法检测胰腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(CTCs) ，分析冷冻消融术前后CTCs变化及其与患者预后的关联性。方法 收集2011年11月至2013年6月暨南大学医学院附属复大肿瘤医院收治的20例行冷冻消融术的胰腺癌患者，使用MACS联合定量PCR法检测患者术前及术后10 d外周血CTCs。治疗后随访2年，记录患者的预后，分析CTCs对患者预后的预测价值。结果 20例患者冷冻术前1 d 外周血CTCs阳性检测率为45.0%，冷冻术后10 d CTCs阳性检测率为15.0%，治疗后患者的CTCs阳性率较术前显著下降，差异有统计学意义(χ2=4.286，P<0.05)。3例术后CTCs阳性患者的中位生存期为5个月，17例术后CTCs阴性患者中位生存期为8个月，CTCs阴性患者的生存期显著长于CTCs阳性患者，差异有统计学意义(χ2=5.552，P=0.0185)。结论 采用MACS联合定量PCR法检测胰腺癌患者外周血CTCs，对评估行冷冻治疗胰腺癌患者的预后有一定临床价值。

胰腺肿瘤； 循环肿瘤细胞； 预后； 冷冻消融术

胰腺癌是世界范围内对人类生存威胁较大的恶性肿瘤，90%的胰腺癌患者在诊断后1年内死亡，5年生存率仅为1%～3%[1-2]。虽然以手术为主的综合治疗可延长生存率，但是5年生存率仍较低，约为4%，即使行根治性切除术，80%的患者2年内出现复发[3-6]。其预后不良的原因主要是转移。大量研究表明，循环血肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)水平是一种可靠的预后指标，它能有效地预测肿瘤患者的进展情况和预后生存期[7-8]。Kurihara等[9]采用免疫磁珠负性富集结合免疫荧光染色的方法检测胰腺癌患者CTCs，结果显示术前检测出CTCs的患者预后不良。本研究采用免疫磁珠负性富集结合荧光定量PCR的方法检测胰腺癌患者冷冻消融治疗前后外周血CTCs的变化，评价其对胰腺癌患者临床预后的应用价值。

材料与方法

一、研究方案

收集暨南大学医学院附属复大肿瘤医院2011年11月至2013年6月入院接受冷冻治疗的胰腺癌患者的病例资料。入组标准：(1)经病理及影像学确诊的4期胰腺癌；(2)患者经综合分析原发灶不可手术切除，且接受冷冻消融治疗；(3)患者签署知情同意书，同意入组。本研究经广州复大肿瘤医院伦理委员会的批准，并在伦理委员会指导下进行。经过整理，共20例胰腺癌患者入组，其中男性12例，女性8例，年龄42～84岁，中位年龄65岁。胰腺导管腺癌16例，其他类型胰腺癌4例。

二、CTCs免疫磁性标记、富集和分选

采集入组患者冷冻消融术前1 d及术后10 d外周血10 ml，分离外周血单核细胞(PBMC)，将分选FC受体(FcR)阻断剂(100 μl)和抗上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)单抗耦联的磁性微珠(100 μl)先后加入样本的细胞悬液混匀，4～8℃孵育30 min，然后将细胞悬液流经置于磁场中的MS分选柱进行EpCAM阳性细胞分选。免疫磁珠分选系统(MACS)和EpCAM阳性细胞分选试剂盒均购自德国美天妮公司，按说明书操作。

三、RNA提取及cDNA合成

采用Trizol(Invitrogen公司) 提取经免疫磁珠富集分离后的细胞总RNA，紫外分光光度计测浓度后，取2 μg mRNA逆转录成cDNA。反应总体积为20 μl，含25 mmol/L MgCl24 μl，Oligod引物1 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，10×RT buffer 2 μl，RNA酶抑制剂0.5 μl，AMV反转录酶0.625 μl。反转录条件：42℃ 60 min，95℃ 5 min，最后反应产物稀释至100 μl，置-20℃冰箱储存。所用试剂均购于大连宝生物工程公司。

四、荧光定量PCR检测

根据GeneBank目的基因的cDNA序列，应用Primer 3.0软件设计跨内含子引物。引物序列见表1，委托生工生物工程(上海)有限公司合成。使用SYBR®PremixExTaqTM(TARAKA，大连)检测mRNA表达。反应体系：cDNA 2 μl，SYBR®PremixExTaqTM10 μl，50×Rox Reference Dye 0.4 μl，10 μmol/L上下游引物各0.4 μl，ddH2O 6.8 μl，总共20 μl。PCR扩增条件：94℃ 5 min， 95℃ 5 s、60℃ 20 s、72℃ 15 s，40个循环。以ACTB为内参。

表1 胰腺CTC表面标志物的扩增引物

五、免疫磁珠负性富集结合荧光定量PCR法的检测

计数106个PANC1胰腺癌细胞，逐级进行10倍稀释，获取105、104、103、102、10、1个胰腺癌细胞，提取RNA，分别与10 ml健康志愿者血标本所提取的RNA相混合后进行定量RT-PCR检测。扩增效率设为96%～104%；斜率设置为-3.1～-3.5和-3.113；R2≥0.99。检测阀值设定在最低样本浓度情况下4个肿瘤标志物同时出现扩增信号时的Ct值[10]，KRT19、MUC1、CEACAM5、BIRC5的检测Ct阈值分别为36.8、37.5、37.6、38.0。任意一个基因的扩增Ct值大于该阀值即为CTCs阳性。

六、统计分析

应用美国San Diego公司GraphPad软件进行统计学分析。采用χ2检验比较冷冻前后CTCs变化，生存率曲线采用Kaplan-Me-ier方法描绘，采用Long-rank检验比较生存期差异。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、冷冻前后CTCs表面标志物表达的变化

冷冻治疗前共9例CTCs阳性，阳性率为45.0%，其中3个标志物均阳性2例，2个标志物阳性7例；术后共3例CTCs阳性，阳性率为15.0%，其中3个标志物均阳性1例，2个标志物均阳性2例。术前阳性的9例中7例术后转阴；1例术前3个标志物阳性，术后2个标志物仍阳性，1个标志物转阴；1例术前3个标志物阳性，术后2个标志物转阴，1个标志物术前为阴性，术后转阳。1例术前阴性者术后3个标志物转阳。20例患者KRT19、MUC1、BIRC1、CEACAM5具体表达情况见表2。冷冻治疗后外周血CTCs阳性率较术前显著下降，差异有统计学意义(χ2=4.286，P=0.038)。

二、治疗后CTCs转阴与预后的关系

20例患者冷冻术后随访2年，3例术后CTCs阳性患者的中位生存期为5个月，17例术后CTCs阴性患者中位生存期为8个月，CTCs阴性患者的生存期显著长于CTCs阳性患者，差异有统计学意义(χ2=5.552，P=0.0185，图1)。

讨 论

肿瘤细胞进入外周血循环称之为CTCs，它们形成的微转移灶是肿瘤远处转移的前提，但并不是所有进入外周血的肿瘤细胞均能够导致远处转移，因为进入循环系统的肿瘤细胞绝大多数会在短期内死亡。由于宿主的免疫识别和机械杀伤作用以及肿瘤细胞自身因素，只有极少数具有高度活力，高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中得以生存，相互聚集或分裂增殖形成微小癌栓，并在一定条件下再次脱离循环系统，进入组织内发展为远处转移灶，因此CTCs是经过体内免疫系统的筛选之后所剩余的肿瘤细胞，其在生物学特性上具有和肿瘤干细胞相似的特点。少数具有干细胞特性的肿瘤细胞可以在不同于原位肿瘤的微环境中存活，称之为循环肿瘤干细胞。

CTCs抵达组织、器官可以形成新的肿瘤，检测这些细胞表面的肿瘤标志物可明确CTCs的存在。目前研究显示，乳腺癌、结直肠癌、脑瘤等恶性肿瘤中CTCs的数量均与患者的预后密切相关[7-8, 11]，De Giorg等[12]对晚期乳腺癌进行PET-CT检查，并检测患者外周血CTCs，结果显示有骨转移患者的CTCs

表2 肿瘤细胞表面标志物mRNA表达情况

注：“-”冷冻治疗前，“+”冷冻治疗后，n.s未发现该基因表达

图1 冷冻治疗患者的术后生存时间

数量显著多于无骨转移者，认为CTCs是影响预后的独立危险因素。本研究利用MACS联合定量PCR法检测胰腺癌外周血KTR19、MUC1、BIRC1、CEACAM5肿瘤标志物，分析胰腺癌冷冻消融术前后外周血CTCs的变化。结果显示20例行冷冻消融术的胰腺癌患者的术前CTCs阳性率为45.0%，术后降为15.0%，术后CTCs阴性患者总生存期显著长于CTCs阳性患者，提示检测外周血CTCs可能在评估冷冻术后患者预后方面有一定价值。至于本研究中有1例术前阴性术后转阳是何原因尚待进一步探讨。

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(本文编辑：屠振兴)

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Change of circulating tumor cells in pancreatic cancer patients detected by magnetic activated cell sorting (MACS) combined with RT-qPCR

MuFeng,ChenJibing,JiangFeng,WangYuan,ZengJianying,YaoFei,NiuLizhi,XuKecheng.DepartmentofOncologicalSurgery,FudaCancerHospital,MedicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510665,China

Correspondingauthor:NiuLizhi,Email:fudaclab@gmail.com

Objective To evaluate the circulating tumor cells (CTCs) in peripheral blood by using magnetic activated cell sorting (MACS) combined with RT-qPCR, and analyze the relationship between CTCs and the prognosis. Methods From January 2013 to December 2014, 20 pancreatic cancer patients underwent cryoblation in Fuda Cancer Hospital Affiliated to Medical College of Jinan University were enrolled. MACS combined with RT-qPCR were used to identify preoperative CTCs and CTCs at 10 days postoperatively. The patients were followed in the next two year, and the prognosis was recorded, then the relationship between CTCs and the prognosis was analyzed. Results In the 20 cases, positive rate of preoperative CTCs was 45%, which decreased to 15% postoperatively, and the difference between the two groups was statistically significant (χ2=4.286,P<0.05). The median survival of 3 patients with positive CTCs was 5 months, and the median survival of 17 patients with negative CTCs was 8 months, the median survival of patients with negative CTCs was significantly longer than those patients with positive CTCs, and the difference between the two groups was statistically significant (χ2=5.552,P=0.0185). Conclusions It is of value to detect the circulating tumor cells in peripheral blood by MACS combined with RT-qPCR. CTCs is a potential indicator for predicting the prognosis of pancreatic cancer with cryoablation.

Pancreatic neoplasms； Circulating tumor cell； Prognosis; Cryosurgery

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.06.002

广州天河区科技计划项目资助(201209kw008)

510665 广州，暨南大学医学院附属复大肿瘤医院肿瘤外科

牛立志，Email: fudaclab@gmail.com

2015-02-02)