安 鹏,郑荣儿,吴佳敏,许益鹏,俞晓平

(中国计量大学 生命科学学院 浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江 杭州 30018)

自1993年科学家首次在秀丽线虫样本中发现microRNA(miRNA)以来,至今已在多种动植物和病毒中发现了数千种miRNA,而在人体内也已发现700多种miRNA[1-2]。miRNA是一类长约21～25 nt的非编码RNA,对控制基因表达与调控至关重要[3]。研究发现,miRNA几乎与所有的细胞生命活动有关,能通过抑制基因表达或降解mRNA来调控细胞发育、凋亡和分化等过程[1,4-5]。在人体不同病理条件下,相关miRNA表达量会发生特定的变化,使得miRNA成为疾病诊断和预后的重要临床标志物之一,目前已被广泛应用于肿瘤、血液疾病和心血管疾病等相关研究中[6-8]。miRNA的检测方法很多,包括原位杂交、微阵列、流式细胞、定量实时PCR等,其优缺点不一,然而miRNA在人的血液中含量甚微,获得高浓度、高质量的miRNA是进行研究的第一步,也是关键的一步[9-10]。

传统的miRNA提取方法无法满足研究的要求,现在常用的miRNA提取方法有芯片法、旋转柱法和磁珠法等[11-13]。磁珠法是近年来新兴的一种核酸提取方法,具有高效性、特异性等优点,被广泛应用于miRNA提取的研究。目前,市面上有很多不同类型用于核酸提取的纳米磁珠,这些磁珠的大小、修饰官能团和生产工艺都有所不同,导致它们核酸提取性能也有很大的差异[14]。除磁珠本身因素的影响外,miRNA提取过程中磁珠用量、裂解液pH等对提取效果也有很大的影响,具体的影响情况又会因磁珠的不同而不同[15]。因此,本研究主要以人标准血清为样本,以Promega磁珠法血清miRNA提取试剂盒为对照,比较研究了三种不同品牌的磁珠在不同磁珠用量和不同裂解液pH条件下的miRNA提取性能。最后建立的一套用于miRNA提取的体系,其提取性能与Promega试剂盒相近,能够替代Promega试剂盒用于临床科研,大大降低了科研成本。

1 材料与方法

1.1 化学试剂与药品

蛋白酶K(Bio-Rad,US)、Tris(Sigma,DE)、MgCl2(Bio-Rad,US)、HCl(国药集团化学试剂有限公司)、异硫氰酸胍(Sigma,DE)、异丙醇(国药集团化学试剂有限公司)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)、KCl(国药集团化学试剂有限公司)、裂解液(实验室配制)、结合液(实验室配制)、清洗液1(实验室配制)、清洗液2(实验室配制)、无核酸酶水、Maxwell RSC miRNA Plasma and Exosome kit(Promega,US)。

1.2 仪 器

QuantStudio 5型qPCR仪(ThermoFisher,US)、Dynamag-2磁力架(ThermoFisher,US)、Maxwell核酸自动提取仪(Promega,US)、PCR仪(ThermoFisher,US)、匀速振荡仪(杭州奥盛仪器有限公司)、电动移液器(Integra,CH)、干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)、pH计(MettlerToledo,CH)。

1.3 样 本

人标准血清,购于公司罗氏(Roche,CH,cat:S5519),于-80 ℃保存备用。

1.4 纳米磁珠

1)LGC磁珠(LGC,UK);2)PuriMag磁珠(厦门普睿迈格生物科技有限公司);3)为度磁珠(WD,苏州为度生物科技有限公司)。

1.5 miRNA的提取

1.5.1 核酸手动提取法

1)试剂准备:裂解液(主要成分为6 mol/L的异硫氰酸胍),结合液(主要成分为99%的异丙醇),清洗液1(主要成分为70%的乙醇和1%的硫代甘油),清洗液2(主要成分为75%的乙醇);

2)样品准备:将-80 ℃保存的标准血清解冻备用;

3)裂解:取1.5 mL无核酸酶离心管,向其中加入200 μL裂解液、200 μL血清样本、1 μL(800 U/mL)蛋白酶K,振荡均匀,56 ℃孵育10 min;

4)结合:向上述裂解样品中加入适量磁珠工作液,振荡均匀后再加入400 μL结合液,置于匀速振荡仪1 500 r/min振荡4 min;

5)洗涤:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器吸去溶液,取下离心管,加入400 μL清洗液1,1 500 r/min振荡2 min;

6)洗涤:将离心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器吸去溶液。取下离心管,加入400 μL清洗液2,1 500 r/min振荡2 min;

7)将离心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器吸去溶液,保持管盖敞开,静置3 min,晾干磁珠;

8)洗脱:从磁力架上取下离心管,向管中加入50 μL无核酸酶水或TE(Tris-EDTA)缓冲液,1 500 r/min振荡4 min;

9)将离心管置于磁力架上,待磁珠完全被吸附后,用移液器将管中提取到的RNA溶液转移到新的无核酸酶离心管中,于-80 ℃保存或直接进行下一步反转录实验。

1.5.2 核酸自动提取法

取血清样本200 μL,按照Maxwell RSC miRNA Plasma and Exosome kit(Promega,US)试剂盒说明书,使用Maxwell核酸提取仪(Promega,US),自动提取miRNA,洗脱体积50 μL。

1.6 miRNA的检测

1.6.1 检测靶标及引物序列

miRNA-363在标准血清中表达稳定,故本研究选择miRNA-363做为检测靶标,反转录引物、qPCR引物序列如表1,均由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 引物名称及序列

1.6.2 miRNA的反转录

将磁珠法提取得到的miRNA样本反转录,反应体系(15 μL)为:H2O 2 μL,RT-primer(1 μmol/L)1.5 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.5 μL,MgCl2(50 mmol/L)1.5 μL,5x RT-Buffer 3 μL,RTase 0.5 μL,RNA样本5 μL。反转录条件为:25 ℃ 10 min,30 ℃ 10 min,35 ℃ 10 min,40 ℃ 10 min,95 ℃ 5 min。

1.6.3 qPCR检测

将反转录得到的cDNA样本用于实时荧光定量PCR(qPCR)检测,反应体系(15 μL)为:H2O 4.65 μL,Xtensa(10 x)1.5 μL,MgCl2(50 mmol/L)0.75 μL,KlearTaq 0.1 μL,qPCR-Primer(1 μmol/L)3 μL,cDNA 5 μL。反应条件为:95 ℃ 10 min,40 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 40 s,95 ℃ 15 s,40个循环。

1.7 提取体系的优化

1.7.1 磁珠量对miRNA提取的影响

按上述实验方法,检测和比较磁珠使用量分别为10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL和40 μL时对miRNA提取的影响,根据荧光实时定量PCR的Ct值(Cycle Threshold)的变化分析不同磁珠的适用量范围。Ct值的大小由样本中提取到核酸模板拷贝数决定,提取得到的模板量越多,Ct值则越小,则提取性能越好。

1.7.2 裂解液pH对miRNA提取的影响

按上述实验方法,用HCl和NaOH调节裂解液的pH,检测和比较在裂解液pH分别为4.8、6.4、7.2、8.0和9.0时对磁珠提取miRNA的影响,根据Ct值的变化分析最适的裂解液pH条件。

2 结 果

2.1 磁珠的选择

构建miRNA提取体系选用的三种不同品牌的磁珠,其材料、密度、粒径大小等都有所不同(表2)。三种磁珠都是Fe3O4磁珠,其中LGC和PuriMag磁珠修饰官能团都为硅羟基,WD磁珠的修饰官能团则为羧基,PuriMag磁珠的密度相对LGC和WD磁珠密度更大。WD磁珠与LGC磁珠和PuriMag磁珠相比,粒径更小。

表2 三种品牌磁珠的比较

2.2 提取体系的构建

1)磁珠用量对miRNA提取效果的影响

裂解液pH均为7.4时,在同样的检测样本量条件下,三种磁珠在不同磁珠使用量条件下提取效率表现不同(图1)。当使用量范围为30～40 μL时,不同磁珠提取所得miRNA qPCR检测的Ct值前后差异不大,是三种不同磁珠较适宜的工作量范围。当磁珠使用量为30 μL时,LGC和WD磁珠的Ct值分布为28.65和28.58,相比于PuriMag磁珠的Ct值30.15具有显著性差异(利用SPSS进行t检验分析,P值分别为0.03、0.026,P≤0.05),这说明与PuriMag磁珠相比,LGC和WD磁珠的提取性能更好。

图1 三种磁珠不同用量条件下的Ct值Figure 1 Ct values of three magnetic beads at different dosages

2)裂解液pH值对miRNA提取效果的影响

当磁珠用量均为30 μL,在同样的检测样本量条件下,在不同裂解液pH条件下,3种不同磁珠的提取效率也表现出一定的差异(如图2)。裂解液pH值太大或太小都会严重影响磁珠的提取性能,pH值在7.0～9.0之间是3种磁珠提取体系较适宜的酸碱工作范围,当pH值为8.0时,三种磁珠的qPCR的Ct值皆最小,说明此时对miRNA的提取效率最高,LGC和WD磁珠的提取效率相比PuriMag磁珠略高,但没有显著性差异。

图2 三种磁珠在裂解液不同pH条件下的Ct值Figure 2 Ct value of the three magnetic beads under different pH conditions

3)3种磁珠提取体系性能的比较

在3种磁珠最适的磁珠用量(30 μL)、pH(8.0)条件下提取相同量的样本,多次重复,并与对照组Promega试剂盒提取结果进行比较,如图3所示,LGC、PuriMag、WD三种磁珠体系以及对照组Promega平均Ct值分别为27.83、28.25、27.5和27.15。利用SPSS显著性差异分析(t检验),LGC、PuriMag与Promega有显著性差异(t检验的P值分别为0.037、0.028,P≤0.05),表明LGC、PuriMag与Promega相比具有明显差距。而WD磁珠提取体系提取miRNA的效率与对照组Promega试剂盒组相比,二者没有显著性差异,提取性能相当。这说明WD磁珠提取体系提取miRNA的效率在3种磁珠提取体系中最高,可以替代Promega试剂盒提取试剂盒。

注:每组实验6次重复

3 讨 论

本研究在传统的核酸提取理论基础的上,以纳米磁珠为核心构建了一套用于miRNA提取的体系,并主要探讨了磁珠用量和裂解液pH对磁珠体系miRNA提取性能的影响。从实验结果来看,磁珠的规格、磁珠用量和裂解液pH对体系提取性能影响明显。市面上有很多不同品牌的磁珠,因其生产方法、原料及生产工艺等的不同,磁珠的直径、修饰官能团、密度也都不同。磁珠的直径越小,磁珠的比表面积越大,有利于对miRNA的吸附;但磁珠太小却不利于与磁棒的结合,在提取过程中流失较多,从而导致提取结果不够理想。在本研究中,LGC和PuriMag磁珠的修饰官能团都为硅羟基,但是在相同条件下,密度更小的LGC磁珠的miRNA提取效率明显要比PuriMag磁珠高(图1,图2)。WD磁珠的修饰基团不同于另外两种磁珠,其磁珠粒径更小(表1),在最适合的磁珠用量和pH条件下,对miRNA提取的效率最高。实验选取的3种磁珠构建体系后提取miRNA效果不同,但单独分析3种磁珠直径对miRNA提取效果没有明显的趋势,可能跟小粒径的磁珠更容易吸附蛋白有关,导致效果区分不明显。

修饰官能团则主要影响磁珠与核酸分子间的结合力,不同官能团与核酸分子的结合力不同,例如氨基修饰的磁珠更容易与带负电的核酸分子结合,而羧基修饰的磁珠则需要盐溶液环境的外部驱动力来吸附核酸[14]。在本研究中,密度相同但修饰官能团不同的WD磁珠和LGC磁珠对miRNA提取效率相比于PuriMag磁珠更为接近,不能反映出硅羟基和羧基这两种修饰官能团对miRNA提取效率的区别。本研究中的三个磁珠体系均是在pH范围7.0～9.0之间时效果较好,在pH为8.0时提取效率最高,说明此时的pH值比较适合三种磁珠的修饰官能团(硅羟基/羧基)对miRNA的吸附,市面上有很多不同官能团修饰的磁珠,例如还有氨基、巯基等官能团修饰的磁珠,它们适宜的pH范围就有所不同,氨基修饰的磁珠适宜pH范围为7.5～9,而巯基官能团修饰的磁珠适宜pH范围为5.8～7[15]。此外,实验pH条件可能会影响裂解液对样本的裂解效果,从而影响核酸的释放量,最终影响提取效率[16]。

本研究以人标准血清为样本,用荧光定量PCR检测靶标miRNA-363,以Ct值的大小来评估3种不同磁珠提取体系的性能,还存在着很多的不足,评估的指标需要进一步的丰富。研究团队接下来会继续对提取体系进行优化,包括对磁珠的筛选、试剂体系盐浓度和成分等的进一步的调整,并在后续中给予分析和介绍。