★　姚亮　李珊珊　于凡　彭代银　(安徽中医药大学　合肥 230031)

正交试验法优选桃红四物汤醇提工艺

★姚亮*第一作者：姚亮，男，硕士研究生。Tel：18256979928，E-mail：766816651@qq.com。李珊珊于凡彭代银*通信作者：彭代银，男，教授，博士生导师。研究方向：中药学。Tel：0551-65169189，E-mail：pengdy@ahtcm.edu.cn。(安徽中医药大学合肥 230031)

摘要：目的:优选桃红四物汤的醇提工艺。方法:以总黄酮含量和浸膏得率为考察指标，以乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数为考察因素，采用正交试验优选桃红四物汤的最佳醇提工艺。结果:桃红四物汤的最佳醇提工艺为加6倍量80%乙醇提取三次，每次1.5h。结论:优选出的桃红四物汤的醇提工艺合理、稳定，可为其工业化生产提供参考。

关键词：桃红四物汤；醇提工艺；正交试验；总黄酮；浸膏得率

桃红四物汤源自于清代吴谦之《医宗金鉴·妇科心法要诀》，由桃仁、红花、熟地、当归、白芍、川芎6味中药组方而成，具有养血活血、祛瘀生新之效，临床上用于血瘀兼有血虚证特别是妇科血瘀证的治疗[1]。古代医家将其用于治疗妇人瘀血内阻、月经失调等证，现代常用于血瘀引起的多种病症，对冠心病、糖尿病、痛经、子宫出血等均有较好疗效，所治病症涉及内、外、妇、儿各科[2]。药理学研究表明，桃红四物汤还具有抗血栓[3]、改善心功能、抗血小板聚集、改善微循环、抗氧化、降低血脂等作用[4]，应用前景广阔，具有进一步研究和开发的价值。在临床用药形式上桃红四物汤多以汤剂为主，虽疗效确切，但存在稳定性差、易霉变、服用不便、携带困难等缺点[5]，使其的应用和推广受到限制，需要改革剂型。根据此方的临床实际应用情况及组方药物的理化性质及成分，可考虑采用颗粒剂、胶囊剂、片剂等口服剂型。但由于本方日服剂量相当于原药材51克，且药材提取物得膏率较大，不易制成胶囊、片剂，故考虑制成颗粒剂。为确保颗粒剂的质量及疗效，本研究对桃红四物汤的醇提工艺进行优选。由于组方中桃仁、红花、当归、川芎四味药的脂溶性成分较多[6-8]，故对以上四味药采用乙醇作为溶剂进行提取，以浸膏得率和总黄酮含量作为指标考察桃红四物汤的最佳醇提工艺。

1材料

1.1药物及试剂桃仁(安徽济人药业有限公司，批号:130331);红花(安徽济人药业有限公司，批号:130406);当归(安徽济人药业有限公司，批号:130625);川芎(安徽济人药业有限公司，批号:130519)；芦丁对照品(批号：120526-201408)；甲醇为色谱纯。

1.2仪器紫外-可见分光光度计(UV757CRT型，上海精科仪器有限公司)；十万分之一分析天平(AB135-S型，梅特勒公司)；电子天平(PL601-S型，梅特勒公司)；旋转蒸发仪(SHB-Ⅲ型，上海亚荣生化仪器厂)；水浴锅(HH-S2型，常州普天仪器制造有限公司)；真空干燥箱(DZF-6050型，上海博讯实业有限公司)。

2方法与结果

2.1总黄酮含量测定[9]

2.1.1对照品溶液的制备取120℃干燥至恒重的芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含0.2mg的溶液，即得。

2.1.2供试品溶液的制备按处方比例称取桃仁9g，红花6g，当归9g，川芎6g，按醇提L9(34)正交试验进行乙醇回流提取，滤液浓缩后置真空干燥箱干燥至恒重，计算浸膏得率。取干浸膏粉适量，精密称定，至50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.1.3最大吸收波长的确定将芦丁对照品溶液在400～600nm波长范围内进行扫描，发现在506nm波长处有最大吸收峰，故选择506nm作为检测波长。

2.1.4标准曲线的测定分别取上述芦丁对照品溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0mL置于25mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加4.3%氢氧化钠溶液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应的试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法，在506nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=14.014X-0.019 4(r=0.999 9)，线性范围为0.008～0.048 mg/mL。

2.1.5精密度考察取一定浓度的对照品溶液4mL，按2.1.4项下操作，连续测定6次吸光度值，其RSD值为0.12%，表明本方法的精密度良好。

2.1.6重复性考察取供试品溶液4mL，按2.1.4项下操作，连续测定6次吸光度值，其RSD值为0.20%，表明本方法的重复性符合要求。

2.1.7稳定性考察吸取供试品溶液4mL，按2.1.4项下操作，分别于显色后0,5,10,15,20,25,30min测定吸光度，其RSD为1.25%，表明供试品溶液在显色后30min内吸光度稳定。

2.1.8加样回收率取同一样品约40.3mg，精密称定6份，按2.1.4.2溶液的制备方法制备供试品溶液，取4mL供试品溶液，采用加样回收试验，分别加入2mL芦丁对照品溶液(0.2mg/mL)，置于25mL容量瓶中，按2.1.4项下步骤进行操作测定其吸光度，平行操作6份，计算其平均加样回收率为98.2%，RSD为0.87%，结果表明方法回收率良好。

2.1.9总黄酮测定法分别吸取对照品溶液与供试品溶液各4mL，按2.1.4项下方法显色后置紫外-可见分光光度计中测定即得。

2.2浸膏得率测定分别按醇提和水提正交试验提取后滤过，得醇提液或水提液，滤液浓缩，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后置真空干燥箱60℃干燥至恒重，计算浸膏得率(浸膏得率=干浸膏质量/药材质量×100%)。

2.3醇提正交试验

2.3.1醇提正交试验设计选用乙醇对桃仁、红花、当归、川芎进行回流提取，以总黄酮含量和浸膏得率为评价指标进行综合评价(浸膏得率和总黄酮含量的权重系数分别为0.4，0.6)，以乙醇浓度(A)、乙醇用量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)为因素，选取三个水平，按L9(34)表进行正交试验，优选最佳的醇提工艺条件，醇提正交试验因素水平表见表1。

表1　醇提正交试验因素水平表

表2　醇提正交试验结果

2.3.2醇提正交试验结果由直观分析可得，对乙醇提取效果的因素影响为A>D>C>B,，最佳工艺的组合为A3B3C2D3。以极差最小的B因素为误差项进行方差分析，结果显示A因素与D因素对醇提工艺具有显著性影响，结合生产实际与成本考虑，选择乙醇提取的最优组合为A3B1C2D3，即乙醇浓度为80%，6倍量提取三次，每次1.5h。

表3　醇提正交方差分析

注：F临界值：F0.05(2,2)=19。

2.3.3验证试验按处方比例称取桃仁9g、红花6g、当归9g、川芎6g，3份，按最优醇提工艺进行试验，结果见表4，表明优选的工艺合理、稳定、可行。

表4　醇提工艺验证试验结果

3讨论

桃红四物汤由四物汤(熟地、当归、白芍、川芎)加上桃仁、红花二味中药组成，临床用于血瘀兼有血虚证的治疗，疗效显著[10]。在桃红四物汤的提取工艺研究中，根据组方药物有效成分的理化性质，采用不同的溶剂进行提取，首先对其中含脂溶性成分较多的桃仁、红花、当归、川芎四味药的醇提工艺进行考察。其中，浸膏得率是工艺优选中的传统指标，总黄酮为方中桃仁、红花、当归、川芎四味药中的有效成分，通过多指标综合评分来全面地评价提取工艺，优选出桃红四物汤的最佳醇提工艺，为今后桃红四物颗粒的研制和开发提供前期必要的基础和有利的保障。

参考文献

[1]韩岚,许钒,章小兵,等.桃红四物汤活血化瘀作用的实验研究[J].安徽中医学院学报,2007,26(1):36-38.

[2]张正升,彭代银.桃红四物汤临床应用研究进展[J].安徽医药,2011,15(9):1 162-1 165.

[3]李翊,彭代银.桃红四物汤的药理学研究进展[J].安徽医药,2011,15(5):529-531.

[4]韩岚,彭代银,许钒,等.桃红四物汤抗血栓形成作用研究[J].安徽中医学院学报,2010,29(1):47-49.

[5]王权,吴德玲,黄金玲,等.多指标正交试验优选苓桂术甘颗粒水提工艺[J].安徽中医学院学报,2013,32(4):87-90.

[6]姜建双,夏鹏飞,冯子明,等.红花化学成分研究[J].中国中药杂志,2008,33(24):2 911-2 913.

[7]李曦,张丽宏,王晓晓,等.当归化学成分及药理作用研究进展[J].中药材,2013,36(6):1 023-1 028.

[8]张晓琳,徐金娣,朱玲英.中药川芎研究新进展[J].中药材,2012,35(10):1 706-1 711.

[9]郑杭生,李计萍,韩炜,等.紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量的方法学考查要点[J].中成药,2008,30(9):1 364-1 365.

[10]丁艳杰,张前德.桃红四物汤临床与实验研究进展[J].江苏中医药,2010,42(1):77-79.

Optimization of Alcohol Extraction Process for Taohong Siwu Decoction by Orthogonal Test

YAO Liang, LI Shan-shan, YU Fan, PENG Dai-yin

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230031,China.

Abstract:Objective: To optimize the ethanol extraction technology for Taohong Siwu Decoction. Methods:With yield of total flavonoids and extract as indexes, orthogonal test was adopted to optimize the ethanol extraction technology by taking the concentration of ethanol,the amount of solvent, extraction time and extraction times as indexes. Results:The optimal process of the ethanol extraction technology was as follows: add 3times with 6 times amount of 80% ethanol, and 1.5h for each time. Conclusion:The optimized ethanol extraction technology was reasonable and feasible, which can be provided as the reference for the industrialized production.

Key words:Taohong Siwu Decoction; Water Extraction Process; Orthogonal Test; Total Flavonoids; Extract

收稿日期：(2014-11-09)编辑：曾文雪

中图分类号：R284.2

文献标识码：A