★　俞允第一作者：俞允，男，讲师。研究方向：医学物理。E-mail:yuyunsatan@6.com。　何雁　陈荣　黄浩通信作者：黄浩，男，教授。研究方向：医学物理。E-mail:mrhhao@6.com。　冯尚源　林居强　黄祖芳　李永增　陈伟炜　林多　林佳　(.福建中医药大学中西医结合学院　福州 50；.江西中医药大学　南昌 0004；.福建师范大学光电与信息工程学院　福州 50007)

基于拉曼光谱的不同产地黄芪鉴别研究*

★俞允1*第一作者：俞允，男，讲师。研究方向：医学物理。E-mail:yuyunsatan@163.com。何雁2陈荣3黄浩1*通信作者：黄浩，男，教授。研究方向：医学物理。E-mail:mrhhao@126.com。冯尚源3林居强3黄祖芳3李永增3陈伟炜1林多1林佳3(1.福建中医药大学中西医结合学院福州 350122；2.江西中医药大学南昌 330004；3.福建师范大学光电与信息工程学院福州 350007)

摘要：目的:利用拉曼光谱技术建立黄芪饮片产地鉴别方法。方法:检测来自内蒙古、山西、黑龙江、甘肃四个地区共100批次黄芪饮片的拉曼光谱，通过主成分分析(PCA)对不同产地样本进行判别区分，利用偏最小二乘判别法(PLS)建立产地判别模型并予以验证。结果:四个产地黄芪饮片拉曼谱线差异主要体现在谱峰强度方面，表明不同产地的黄芪饮片所含生化物质在组成比例上有较大差异。PCA分析可对不同产地的黄芪饮片进行区分，主成分得分PC1、PC2、PC3构成的三维散点图中，代表不同产地的数据散点各自聚集，没有重叠。PLS产地判别模型可正确鉴别内蒙古、山西、黑龙江、甘肃等四产地黄芪饮片。结论:本研究表明拉曼光谱技术结合PCA及PLS方法，可实现黄芪饮片产地的快速鉴别。同时该方法还可拓展应用于其他饮片产地鉴别，具有良好应用前景。

关键词：黄芪；拉曼光谱；主成分分析；偏最小二乘法

黄芪是我国重要的传统饮片，具有多种保健养生治疗的功效，如固表止汗、利尿、补气升阳、生肌等[1-2]。以黄芪为药材的药方众多，黄芪饮片需求量大。然而，不同产地黄芪饮片由于品种、生态地理环境、气候以及栽培加工技术等差异，使得不同地域黄芪饮片具有不同的生物活性，在色泽、纹理、形状、疗效上均有区别。

目前主要采用传统的形态学特征对黄芪产地进行鉴定，这对鉴定者技术经验要求高，并且鉴定结果存在一定主观性。现代理化分析如分光光度法、色谱法、显微鉴别法、红外光谱法等[3-4]都需对样品进行预处理，且步骤烦琐、成本高、费时费力。因此，建立一种操作简便、结果客观、费用低廉的黄芪饮片产地鉴定方法对于黄芪饮片质量监控具有重大意义。

拉曼光谱技术是一种快速、简便的物质检测方法，能够在分子水平对待测物质进行准确检测。近年来拉曼光谱技术已经被广泛应用于中药检测，包括中药饮片真伪鉴定、质量控制和成分分析等方面[5-7]。本课题组利用拉曼光谱技术研究党参饮片、白术饮片、黄芪饮片、泽泻汤剂以及白芍药汤剂的生化成分，已获得初步成果[8-12]。

本研究尝试将拉曼光谱检测技术结合主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)及偏最小二乘法(Partial Least Squares，PLS)等数据分析方法，应用于黄芪饮片不同产地快速鉴别分析。

1材料

黄芪饮片由福建中医药大学国医堂提供，药学院鉴定。饮片产地分别为：内蒙古(产地分类赋值1)、山西(赋值2)、黑龙江(赋值3)、甘肃(赋值4)，每个产地共获取25批次样本，具体信息见表1。将不同产地的黄芪饮片用超纯水(Simplicity水纯化系统，MILLIPORE公司)洗净后晾干，在60℃烘箱中烘干至恒重，冷却后经高速饮片粉碎机粉碎，过100目筛后储存备测。每批次黄芪饮片制备成一份待测样本，四产地共计100份样本。

2方法

2.1拉曼光谱检测采用Renishaw Invio显微共聚焦拉曼光谱仪进行拉曼光谱检测。激发光源为近红外半导体激光器，波长785 nm，照射到样品表面的激发光功率约100 mW。在20倍Leica物镜下采集拉曼信号，CCD积分取谱时间10 s，取谱范围500～1800 cm-1，光谱分辨率为2 cm-1。采集时温度、湿度保持恒定。

将待测样品粉末置于载玻片上，均匀压片后任意位置进行检测，共检测10个位置拉曼信号。为了消除仪器激光强度波动对检测结果的的影响，我们将获得的光谱数据分别进行荧光背景扣除[13]和归一化处理(500～1800 cm-1，谱线下面积积分)，最后取每个样本测得的十条谱线的平均谱作为该样本的拉曼特征谱。

表1　黄芪样品产地来源、分类及批数状况

2.2统计分析从每个产地的25个样本中均随机抽取20个黄芪样本的拉曼特征谱进行建模(定标集)，剩余5个样本用于预测(验证集)。最终定标集样本共80样(每个产地20样)，验证集样本20样(每个产地5样)。

采用Unscrambler95软件(CAMO,ASA Oslo,Norway)对定标集中80条黄芪拉曼特征谱数据进行主成分分析(PCA)，并以偏最小二乘法(PLS)建立产地分析模型[14]。该模型以定标集中光谱数据作为输入变量x，以四个产地山西、甘肃、内蒙古、黑龙江的产地分类赋值1、2、3、4作为输出变量y，验证方法采用杠杆率校正法(Leverage correction)。并以验证集中的20个黄芪样本拉曼特征谱数据作为未知样本对模型进行检验。

图1　内蒙古、山西、黑龙江、甘肃四产地黄芪拉曼光谱

3结果

3.1四产地黄芪饮片拉曼光谱图1为内蒙古、山西、黑龙江、甘肃四个产地黄芪样本的拉曼光谱，谱线阴影部分为标准差，代表同一产地中不同批次样本谱线之间的波动性。表2为黄芪饮片拉曼谱峰所对应的各种物质成分[15-16]。

表2　拉曼谱峰位置及归属

3.2四产地黄芪饮片拉曼光谱PCA分析如图1所示，山西产地的黄芪饮片拉曼光谱与甘肃、内蒙古和黑龙江三地黄芪饮片拉曼光谱差异明显，但后三者光谱差异不明显，难以直接通过拉曼光谱对产地进行判定。因此，使用PCA对四个产地的黄芪饮片拉曼光谱进行统计分析。

图2　四产地黄芪样本拉曼光谱的主成分分析

图2为PCA散点分布图，PC1、PC2、PC3分别作为X、Y、Z轴。如图2所示，代表不同产地的数据点分别聚集到独立的区域，彼此之间没有交集。这一结果说明利用前三个主成分能够较好区分来自四个产地的80个样本。

3.3黄芪饮片产地判别模型在PCA分析基础上，利用PLS方法建立黄芪饮片产地的判别模型。图3是获得的判别模型，相关系数R2达到0.994，说明该判别模型具有较好的精度，可以很好地实现定标集中四个不同产地黄芪饮片的识别。

图3　PLS判别模型的标准值与预测值散点图

为验证该模型对未知样本的产地判别适用性，利用未参与建模的验证集样本(每个产地5个，共20个样本)对模型进行验证，结果如图4所示：判别模型预测20个样本的正确率达到100%，说明拉曼光谱技术结合PLS方法能够正确预测内蒙古、山西、黑龙江、甘肃四产地的黄芪饮片。

图4　PLS判别模型对验证集的预测结果

4讨论

由图1和表2可知，四个产地黄芪饮片拉曼光谱均含有520、605、638、853、975、1004、1057、1123、1206、1265、1338、1380、1458、1602、1655 cm-1等拉曼峰；其余拉曼峰如457、578、591、768、899、909、941、1081、1095、1104、1293、1409、1533、1630 cm-1等同时存在于两地或三地的拉曼谱线中。比较不同产地黄芪同一拉曼谱峰位置对应的拉曼强度发现，不同产地的黄芪饮片所含的同类生化物质在组成比例上存在较大差异，即不同产地样本所含的多糖类、蛋白质类等生化物质的含量高低不同。此外，不同产地黄芪饮片拉曼光谱谱峰位置也存在微小差异，这表明不同地区黄芪饮片所含化学物质成分或结构方面也存在一定差异。造成以上这些的原因可能是饮片种质、生态自然环境(如气候、地质土壤中各种元素组成及含量等)、栽培加工以及质量控制等多方面因素共同作用的结果[17-18]。

由于甘肃、内蒙古、黑龙江产地的黄芪饮片拉曼光谱差异极小，因此我们使用PCA分析进一步提取四个产地黄芪饮片的特征光谱信息。PCA散点图中(图2)，代表甘肃、内蒙古、山西、黑龙江四地的数据散点各自聚在一起，尤其是前二者，也呈现较明显的空间分布趋势，即相同产地黄芪饮片样本分布更加紧密，反映同一产地不同批次黄芪饮片样本之间的成分相似性较高。

基于PCA分析的良好结果，我们采用PLS方法进一步建立可用于判别黄芪饮片产地的判别模型。从判别结果来看(图4)，该判别模型具有良好的黄芪饮片产地区分能力(区分正确率100%)，说明拉曼光谱结合PLS方法在黄芪饮片产地的快速鉴别方面具有极大潜力。后续工作中我们将进一步扩大黄芪饮片的产地来源，同时加大各产地样本数量，完善黄芪饮片的产地判别模型。

5结论

我们将具有高检测灵敏度的拉曼光谱检测技术与PCA、PLS统计分析技术相结合，应用于黄芪饮片产地鉴别，建立的黄芪产地判别模型具有100%的区分正确率(80个样品用于建模，20个样品用于预测)。该方法有望进一步推广应用于其他饮片产地鉴别及饮片真伪判别，具有良好的应用前景。

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Discrimination of Radix Astragali seu Hedysari from Different Producing Areas Using Raman Spectroscopy

YU Yun1, HE Yan2, CHEN Rong3, HUANG Hao1, FENG Shang-yuan3, LIN Ju-qiang3, HUANG Zu-fang3, LI Yong-zeng3, CHEN Wei-wei1, LIN Duo1,LIN Jia3

1.CollegeofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122，China;

2.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China;

3.CollegeofOptoelectronic-InformationalEngineering,FujianNormalUniversity,Fuzhou350007，China

Abstract:Objective:To discriminate Huangqi (Radix Astragali seu Hedysari) from different producing areas using Raman spectroscopy. Methods:The Raman spectroscopy of 100 batches of Huangqi from four producing areas of Inner Mongoli, Shanxi, Heilongjiang, and Gansu were measured and analyzed by principal component analysis (PCA) method to discriminate between samples from different producing areas. The discriminant model of producing areas based on partial least squares analysis (PLS) was establish and verified. Results:The differences between Raman spectra of Huangqi samples from five producing areas mainly displayed in the peak intensity of the spectrum, indicating that the biochemical substances contained in Huangqi from different areas have a significant difference in the composition ratio. The PCA could distinguish samples from different producing areas. In the 3-D scatter plot with PC1, PC2 and PC3 score as the three axes, five kinds of representative symbols for four different producing areas were effectively classified, without any overlap. Moreover, PLS discriminant model can correctly identify the producing areas of the Huangqi samples from Inner Mongoli, Heilongjiang, and Gansu. Conclusion:The results demonstrate that the combination of Raman spectroscopy technology, PCA and PLS can successfully identify origins of Huangqi, showing great potential of this method in the origin identification of other medicinal herbs.

Key words:Huangqi (Radix Astragali seu Hedysari); Raman spectroscopy; Principal Component Analysis (PCA); Partial Least Squares (PLS)

收稿日期：(2015-03-24)编辑：曾文雪

中图分类号：R282.7

文献标识码：A

基金项目：国家自然科学基金项目(61178090)；福建省自然科学基金项目(2013J01330)；陈可冀中西医结合发展基金资助项目(CKJ2011010)。