★　林海鸣第一作者：林海鸣(975—)，男，硕士，讲师。研究方向：中西医结合基础。E-mail：flashlhm@tom.com。　郑敏麟通信作者：郑敏麟。E-mail：809040@qq.com。　阮诗玮　董卫国　谢永财　李长征　(.福建中医药大学中西医结合学院　福州 350；.福建中医药大学附属人民医院　福州 350004)

*基金项目：福建省卫生系统中青年骨干人才培养计划重点项目(2013-ZQN-ZD-26)；福建省科技厅重点项目(2000Z154)；福建省卫生厅中医药科研计划项目(wzy0902)。

水湿困脾证与线粒体的关系研究*

★林海鸣1*第一作者：林海鸣(1975—)，男，硕士，讲师。研究方向：中西医结合基础。E-mail：flashlhm@tom.com。郑敏麟1*通信作者：郑敏麟。E-mail：809220140@qq.com。阮诗玮2董卫国1谢永财1李长征1(1.福建中医药大学中西医结合学院福州 350122；2.福建中医药大学附属人民医院福州 350004)

*基金项目：福建省卫生系统中青年骨干人才培养计划重点项目(2013-ZQN-ZD-26)；福建省科技厅重点项目(2000Z154)；福建省卫生厅中医药科研计划项目(wzy0902)。

摘要：目的：探讨水湿困脾证的病理学基础，以期对中医脾的实质与线粒体的关系做更深入的研究。方法：利用SD大鼠行5/6肾切除术，制备水湿困脾动物病理模型，实验分组为假手术组、培土制水方大剂量治疗组、培土制水方小剂量治疗组、模型组。治疗组给予培土制水方干预，观察各组Scr、BUN、MDA、SOD值，以及心和小肠超微结构的改变。结果：培土制水方大、小剂量组Scr、BUN、MDA均显著低于模型组(P<0.05)；培土制水方大、小剂量组SOD均显著高于模型组(P<0.05)。电镜观察心、小肠超微结构，模型组的病变最重，部分线粒体明显肿胀；培土制水方大、小剂量组的病变轻，线粒体形态无明显改变。结论：培土制水方能减少“水湿困脾”证大鼠心肌及小肠细胞线粒体的损伤，推测其具有清除和减少产生自由基、降低膜脂过氧化反应，从而减少线粒体和组织细胞受到毒素损害而起到保护作用。为进一步验证“脾”的微观实质是细胞器之线粒体提供实验依据。

关键词：水湿困脾；培土制水；慢性肾功能衰竭；尿毒症毒素；线粒体

2002年笔者曾提出了“中医藏象实质细胞生物学假说”(以下简称“藏象假说”)，指出中医藏象的微观实质是亚细胞结构，其中，中医“脾”的实质是线粒体，并通过实验验证了肾小管细胞线粒体是“脾制水”的物质结构基础[1-5]。那么，什么是“脾恶湿”、“水湿困脾”的病理学基础呢？该病理学基础与线粒体相关性如何？揭示“脾”藏象中医证型的微观病理学基础，对进一步理解中医藏象的实质有重要意义。

本研究通过制作5/6肾切除大鼠动物模型，使其水液代谢障碍、代谢废物潴留而产生“水湿困脾”之证，然后观察“水湿”的程度(以血肌酐、尿素氮水平为代谢废物衡量指标)、与各系统器官(以心、小肠组织为代表)的实质细胞线粒体形态学变化，以及“培土制水”法方药的干预作用的实验结果，来阐明“脾恶湿”、“水湿困脾”和“脾制水”与线粒体的相关性，以期阐明“中医藏象脾的实质是线粒体”这一假说中关于“水湿困脾”证的病理学本质。

1实验材料

1.1实验动物雄性SD大鼠32只，由中科院上海动物饲养中心提供，清洁级，体重180-220g。医学实验动物环境设施为福建中医学院动物实验中心,清洁级。

1.2实验药物培土制水方颗粒主要包括太子参、白术、茯苓、山楂、大黄等药味，原药材由福建省医药公司购买，福建省人民医院制剂室进行制剂，每克颗粒含原生药1克。

1.3主要试剂和仪器仪MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所)；低温高速离心机(BECKMAN 64R,美国)；全自动生化分析仪(BECKMAN-CX5,美国)；透射电镜(日立Hu-12A，日本)。

2实验方法

2.1动物造模及实验分组32只SD雄性大鼠适应性饲养5天后，随机分为手术组24只、假手术组8只，手术组大鼠行5/6肾切除术，假手术组按上述手术程序进行，但不切除肾脏。手术组在术后1个月按随机分组原则分成培土制水方大、小剂量治疗组和模型组，每组各8只。

2.2药物治疗培土制水方大、小剂量组分别予以喂服培土制水方20g/kg·d、10g/kg·d，以蒸馏水2.5mL溶解喂服，模型组和假手术组喂服蒸馏水2.5mL/d。各组喂服2个月后，分别取材，检测相关指标及电镜观察。

2.3标本取材及处理、血：内眦静脉丛取血4mL，静置，2000r/min离心10min，取血清于EP管中备用。心、小肠组织：在采集血标本后迅速采集，用4℃的1.5%多聚甲醛-3%戊二醛-0.1mmol/L磷酸盐缓冲液固定后再切成1×1×1 mm3的小块，置于电镜固定液的瓶中保存，备做电镜检查。

2.4观察项目和检测方法

2.4.1Scr、BUN、MDA、SOD检测检测肾功能指标Scr、BUN及氧化损伤指标MDA、抗氧化损伤指标SOD。黄嘌呤氧化酶法检测S0D，硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法检测MDA，尿酶法检测BUN，速率法检测Scr。

2.4.2电镜观察电镜取材标本置于4℃的固定液(同前)前固定4h后，用1%锇酸后固定1.5h，梯度丙酮脱水后，环氧树脂618包埋，超薄切片机切片，经醋酸铀和枸橼酸铅染色，透射电镜(日立Hu-12A型)进行观察。

3统计方法

4结果

4.1各组Scr、BUN、MDA、SOD比较模型组与假手术组相比，肾功能指标明显升高，符合CRF造模的结果，且MDA明显升高，SOD明显降低；培土制水方大、小剂量组分别与模型组相比，肾功能指标明显下降，显示药物干预后大、小剂量治疗组均有治疗作用，且MDA明显降低，SOD明显升高。见表1。

±s)

注：与模型组比较＊P<0.05,＊＊P<0.01。

4.2电镜观测各组心肌、小肠超微结构变化

4.2.1心肌(1)模型组：可见多数心肌细胞的肌丝肌节整齐且Z带清晰，较少量的心肌细胞见轻度水肿且肌丝排列扭曲、稀疏，肌原纤维的间隙增大，少数心肌细胞呈局灶性溶解坏，少数肌质网见扩张，线粒体体积增大、肿胀明显，无炎症细胞浸润心肌细胞间质。见图1。(2)培土制水方治疗组：和模型组比较，超微结构形态较好，绝大多数的心肌细胞肌丝肌节整齐且Z带清晰，较少的心肌细胞出现水肿，极少数心肌细胞呈局灶性溶解坏死。肌质网及线粒体无明显改变，无炎症细胞浸润心肌细胞间质。见图2。

4.2.2小肠(1)模型组：可见小肠粘膜的上皮层比较完整，大多数小肠柱状上皮细胞微绒毛排列较规则，少数柱状上皮细胞微绒毛见缺失，粘膜层可见浸润的淋巴细胞，数量较多的线粒体体积增大、肿胀明显，及其基质内电子致密颗粒减少。见图3。(2)培土制水方治疗组：与模型组比较，小肠粘膜的上皮层完整，无溃疡、糜烂。柱状上皮细胞排列规则，粘膜层偶见少量浸润的淋巴细胞。多数上皮细胞粗面内质网和线粒体形态正常，极少数线粒体见轻度肿胀、嵴减少，及其基质内电子致密颗粒减少。见图4。

图1　模型组：心肌膜下肌丝溶解，个别线粒体肿胀(×10000)

图3　模型组：小肠线粒体肿胀(×7000)

5讨论

5.1慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure, CRF)与“水湿困脾”证肾脏的基本功能之一是对水液(包括代谢废物、水及电解质)的代谢调节。当慢性肾脏疾病导致肾实质持续损害、健存肾单位的数目不足以维持正常的水液代谢时，就进入了CRF的失代偿期，其直接后果是导致了各种代谢废物无法通过肾脏排出体外，而在体内大量潴留。在CRF的尿毒症期，有明显的水、电解质和酸碱平衡紊乱，体内有200多种潴留的物质，其中许多是具有生物活性的有毒化合物(尿毒症毒素)，通过循环系统到达全身，引起全身多系统、多脏器的形态学损害和机能障碍，但其毒素致病机理尚未完全阐明。

中医有“脾制水”和“脾恶湿”的理论，如《素问·至真要大论》说：“诸湿肿满，皆属于脾。”吴崑在《医方考》中说：“湿淫于内者，脾土虚弱不能制水而湿内生也。”《景岳全书·肿胀》指出：“盖水为至阴,故其本在肾……水唯畏土，故其制在脾。”又云“今脾虚则土不制水而反克。”中医理论认为，当津液无法正常运化而潴留时，就形成病理产物“水湿痰饮”；其聚于身体局部的为“痰”为“饮”，弥漫周身者为“水”为“湿”。因此，按照中医理论，这些潴留在体液内的代谢废物(即所谓的尿毒症毒素)，就是“水湿”之邪，而尿毒症毒素引起全身各系统的损害和功能障碍、代谢障碍所表现出来的身体困重无力、纳少便溏等临床症状，按中医辨证属“水湿困脾”证。

5.2“藏象假说”线粒体是中医藏象“脾”的微观实质[1-5]

5.2.1中医藏象实质的细胞生物学假说2002年笔者提出了“藏象假说”[1-2]，指出藏象的本质是在细胞和亚细胞结构，中医“五藏”的微观实质是细胞的五个不同功能系统，对应为五个不同的亚细胞结构，即中医之“心”-离子通道，中医之“肝”-配体-受体-信号转导系统，中医之“脾”-线粒体，中医之“肺”-细胞膜，中医之“肾”-染色体。

5.2.2中医藏象中“脾”的微观实质是线粒体线粒体是细胞氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要场所，线粒体的三羧酸循环是三大营养物质(糖类、脂类、蛋白质)分解的共同途径和最终通路。机体从消化系统(中医之“胃腑”)摄入的三大营养物质(中医之“水谷精微”)，通过线粒体的氧化磷酸化合成能源物质ATP(中医之“气”),为细胞乃至机体提供了能量。这一过程体现了“脾主运化”的机能中最重要的一方面，即营养物质在线粒体中的生物氧化及产生能量的过程。此外，三羧酸循环的中间产物，为细胞其他合成代谢提供小分子前体，因此，线粒体是细胞乃至整个机体生命活动的枢纽和核心。这与中医理论认为“脾胃为后天之本,气血生化之源”的认识是一致的。线粒体又是对体液环境高度敏感的细胞器，病变时机体内环境稳态失衡，细胞外液中PH值、渗透压改变、缺氧及各种毒素等(水湿之邪)，都可能损害线粒体的结构及功能，这又与中医“脾恶湿”的特性相契合。

所有代谢旺盛、对能量需求高的脏器，其组织细胞内都富含有线粒体，如肌肉的收缩、肾小管的重吸收、肝脏参与的物质代谢等均要消耗大量能量，相应的，这些脏器的组织细胞(肌细胞、肾小管细胞、肝细胞)内线粒体数量众多，这与中医理论中“脾主肌肉四肢”、“脾制水”、“脾主运化水谷精微”的观点密切相关。目前已有学者[6]从线粒体生物合成中能量代谢方面探讨线粒体与“脾主肌肉”相关性研究，其它方面有待更深入的实验研究探讨。

5.3“水湿困脾”证、“培土制水”法与线粒体

5.3.1“水湿困脾”证与线粒体线粒体是内毒素的作用靶位[7-9]，内毒素血症的发病机制中，可见细胞线粒体内源性氧自由基产生增加及其对线粒体呼吸功能造成氧化损伤，线粒体功能障碍在感染性休克及多器官衰竭的发生发展中都起到了重要作用。虽然目前的实验研究并未阐明内毒素和尿毒症毒素对机体具有相同的损伤机制，然而研究显示CRF末期也出现自由基的明显升高[10-11]及组织细胞线粒体的结构和功能异常[12-13],作为尿毒症毒素之一的甲状旁腺激素(PTH)，能使氧化磷酸化耦联分离，并损伤心肌细胞线粒体[14]。此外，CRF一直都存在水、电解质及酸碱平衡失调，而线粒体是一种对体液环境敏感的细胞器，容易受其变化而出现异常[15]。无论是自由基的增多还是体液稳态的失调均与细胞器线粒体有密切的关系，因此内毒素及尿毒症毒素有可能是同一致病机理，即尿毒症毒素可能也是通过无差别地损害全身组织细胞的线粒体，从而引起全身多系统的广泛损伤。

实验结果显示，CRF模鼠心和小肠细胞线粒体出现明显肿胀，体内氧化损伤指标MDA升高、抗氧化损伤指标SOD下降，显示自由基清除酶活性下降，自由基生成过多，引起膜不饱和脂肪酸的脂质过氧化及代谢产物MDA增加，且MDA升高的程度与尿素氮、肌酐的水平呈正相关。血清自由基增多是全身组织细胞自由基增多的间接表现，因CRF时肾小管呈高代谢状态，而其他组织器官无高代谢，因此可能是由于全身组织细胞的线粒体氧化磷酸化效率下降，使自由基的产生增多。

因此笔者推测，线粒体(中医之脾)可能是尿毒症毒素(水湿之邪)的作用靶位。其机理可能与细菌内毒素的致病机理相似，即在尿毒症毒素作用下损伤了线粒体的功能，使自由基生成过多，进而引起线粒体膜或线粒体DNA(mtDNA)氧化损伤，甚至导致细胞的凋亡，而出现全身多系统、多器官病变的表现，表现为“水湿困脾”之证。

5.3.2“培土制水”法与线粒体培土制水方以太子参、白术、茯苓、生黄芪、陈皮、山楂、大黄、桑椹、当归、玉竹等药味组成，太子参、白术、茯苓、生黄芪健脾益气，陈皮、山楂助脾运化，大黄泄脾浊，桑椹、当归、玉竹补脾阴，全方具培土制水之功。

实验显示，本方可减轻心和小肠细胞受尿毒症毒素的损害，能减少线粒体形态异常，降低CRF患者血清自由基水平；推测是因为本方有提高细胞线粒体氧化磷酸化效率，减少自由基产生的药理作用，从而起到保护组织细胞线粒体，减轻受到尿毒症毒素损害的结果。

研究表明，中药太子参、黄芪、白术等均能改善细胞线粒体的功能，清除氧自由基[16-18]。大黄能延缓慢性肾功能衰竭的进展[19]，其药理机制就是大黄素、大黄酸等大黄的有效成份影响了线粒体呼吸功能，从而抑制了肾脏高代谢，减少生成自由基，对肾脏起到保护作用[20]。本实验表明，培土制水方能保护组织细胞的线粒体(“培土”)，所以明显减轻尿毒症毒素对心和小肠细胞及其线粒体的损伤，起到了治疗“水湿困脾”证的作用。

5.4小结中医藏象“脾”的微观实质是线粒体。机体水液代谢的异常导致组织间隙中的组织液的成份异常，即“水湿”。由于机体组织细胞对组织液的成份高度敏感和依赖，组织液成份的异常导致了组织细胞线粒体的形态和功能异常，这就是“水湿困脾”证的病理学基础。实验表明“培土制水”方能保护线粒体、改善线粒体形态和功能，从而达到治疗“水湿困脾”证的疗效。

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The Research Between "Water Wet Trapped Spleen" Syndrome and the Mitochondria

LIN Hai-min1, ZHENG Min-lin1, RUAN Shi-wei2, DONG Wei-guo1, XIE Yong-cai1, LI Chang-zheng1

1.InstituteofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China;

2.TheAffiliatedPeople'sHospital,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China.

Abstract:Objective:To explore the essence of the TCM "spleen" relationship with the mitochondria by studying the pathological basis of the "water wet trapped spleen" syndrome. Methods：Made Model of the rat of "water wet trapped spleen" syndrome by 5/6 nephrectomy. Randomly divided into model group、High-dose treatment group、Small dose treatment group and Sham operation group. Comparison between groups of Scr、BUN、MDA、SOD of change,Observation the change of ultrastructure of heart and small intestine. Results：Results of Scr、BUN、MDA in High-dose treatment group and Small dose treatment group were lower than model group(P<0.05).Result of SOD higer than model group(P<0.05).Ultrastructure of heart and small intestine in electron microscope showed the most lesions in model group.Part of the mitochondria swollen markedly. The mitochondria morphology of treatment group has no obvious change.Conclusion：Speculated that the granule protected the mitochondria and tissue cells by Reducing the membrane lipid peroxidation and free radicals.To test the theory that TCM "Spleen" micro-substance was cell mitochondria provided the experimental basis.

Key words:Water Wet Trapped Spleen; Strengthening Earth to Control Water; Chronic Renal Failure Uremic Toxins; Mitochondria

收稿日期：(2014-12-25)编辑：王河宝

中图分类号：R256.3

文献标识码：B