葛 群，李文静，任天恒，李 治，任正隆

(四川农业大学 农学院，四川 成都 611130)

小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂的变异

葛 群，李文静，任天恒，李 治，任正隆

(四川农业大学 农学院，四川 成都 611130)

【目的】 研究小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂的变异，为1BL.1RS在小麦育种中的进一步应用提供依据。【方法】 利用 GISH和 FISH技术从小麦品种绵阳11(MY11)和白粒黑麦远缘杂交的后代中筛选1R(1B)代换系G1和1BL.1RS易位系G2。选用小麦染色体1B上的40对引物对亲本MY11、白粒黑麦、G1、G2以及普通小麦中国春(CS)进行SSR分析。【结果】 6对引物在MY11、CS及G2中扩增出1BL的条带，在G1和白粒黑麦中未扩增出条带，其中3对引物 (Xgwm259、Xbarc188，Xgwm268)在亲本MY11及后代1BL.1RS易位系(G2)中扩增出差异性的1BL条带，说明在小麦-黑麦远缘杂交产生的易位系后代中，1BL染色体臂发生变异。有13对引物在MY11、白粒黑麦和G1、G2中扩增出差异性条带，说明在小麦-黑麦远缘杂交后代中小麦微卫星发生了一定的变化；引物Xbarc8能扩增出白粒黑麦染色体1RS的特异条带，且该条带稳定出现，可以作为白粒黑麦1RS染色体识别和鉴定的分子标记。【结论】 小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体臂发生变异，Xbarc8是鉴定白粒黑麦1RS染色体臂的新的分子标记。

小麦；黑麦；1BL.1RS易位系；1R(1B)代换系；微卫星序列

小麦-黑麦 1BL.1RS易位染色体在小麦育种中已被广泛应用，世界上有数百个小麦品种含1BL.1RS易位染色体[1]。目前，因1RS携带的抗病基因被新的病原生理小种所克服[2-3]，1RS在小麦育种中的应用遇到了瓶颈。因此，对1BL.1RS易位染色体遗传多样性的研究显得极为重要[4-5]。前人对1BL.1RS染色体多样性的研究主要集中在1RS的多样性和着丝粒结构的变异方面[6-8]，而对1BL的变异情况尚未见相关研究。1BL染色体臂作为1BL.1RS易位染色体的组成部分，其变异对1BL.1RS染色体作用的发挥会产生重大影响，如对染色体结构、染色体行为产生一定的影响。因此，1BL染色体臂变异的研究，对1BL.1RS易位在小麦育种中的应用具有重要意义。

在众多研究基因组变异的工具中，简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)是一个重要的工具，也被称作微卫星序列(Microsatellite) ，它是以1～6个碱基为基本单元的串联重复序列，侧翼序列大多是保守的单拷贝序列[9]，广泛分布于植物基因组中。SSR具有重复性好、多态性高、数量多、覆盖性好等优点，因此常被用于进行植物多样性分析[10-11]及基因定位[12]。在植物遇到应激时，包括环境影响、远缘杂交及体外培养均可能造成重复序列的改变[13-14]。已有报道在小麦-黑麦、小麦-大麦远缘杂交形成双二倍体以及人工合成小麦过程中微卫星发生改变[15-17]。

本研究利用定位于1BL染色体臂上的微卫星标记，检测1BL.1RS染色体中1BL染色体臂的变异情况，为1BL.1RS在小麦育种中的进一步应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料G1、G2是普通小麦品种绵阳11(MY11)和白粒黑麦远缘杂交F1与亲本MY11回交所得的BC1经过连续自交得到的较稳定材料。MY11、白粒黑麦、中国春(CS)均由四川农业大学作物遗传育种重点实验室提供。

1.2 植物DNA提取

绵阳11、白粒黑麦、G1、G2和中国春基因组DNA提取参考Zhang等[18]的方法。

1.3 基因组原位杂交和双色荧光原位杂交

利用基因组原位杂交(GISH)和双色荧光原位杂交(FISH)方法，分别使用黑麦全基因组DNA、Aegilopstauschii重复序列pAs1和黑麦重复序列pSc119.2作为探针，对材料G1、G2的染色体结构组成进行鉴定。黑麦全基因组DNA和重复序列pAs1使用Texas Red-5-dUTP (Invitrogen)进行标记，重复序列pSc119.2利用Alexa Fluor-488-5-dUTP (Invitrogen)进行标记。有丝分裂中期染色体制备，探针标记、GISH以及FISH参照Han等[19]描述的方法。采用荧光显微镜Olympus BX51观察染色体并照相。

1.4 引物的选择和PCR扩增

用http://wheat.pw.usda.gov 网站公布的位于小麦染色体1B上的40对SSR引物对试验材料进行分析。PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳的程序和方法参照李雪[20]描述的方法。

2 结果与分析

2.1 GISH和FISH鉴定结果

为了准确鉴定材料G1、G2的染色体组成，采用普通小麦中国春(CS)全基因组DNA作封阻，黑麦全基因组DNA和重复序列pSc119.2、pAs1分别为探针，对材料G1、G2进行GISH和FISH分析，结果显示：材料G1根尖细胞中含有42条染色体，其中包含40条小麦染色体，而1对小麦1B染色体被1对黑麦1R染色体替换(图1A)；材料G2根尖细胞中含有42条染色体，包括40条小麦染色体和2条1BL.1RS易位染色体(图1B)。综上证明材料G1是1R(1B)代换系，材料G2是1BL.1RS易位系。

2.2 不同小麦材料SSR引物扩增结果

2.2.1 染色体臂1BL的变异 利用小麦染色体1B上的40对引物对小麦-黑麦1BL.1RS易位系G2、1R(1B)代换系G1和亲本MY11、白粒黑麦以及中国春全基因组DNA进行SSR分析，结果显示，6对引物(Xgwm268、Xgwm259、Xbarc188、Xbarc80、Xbarc61、Xwmc728)在MY11、CS及G2中扩增出1BL的条带，在G1和白粒黑麦中未扩增出条带，其中3对引物(Xgwm268、Xgwm259、Xbarc188)在亲本MY11和G2中扩增条带存在差异(图2)，Xgwm268在G2中的扩增产物较在亲本MY11中扩增产物变长；Xgwm259在G2中的扩增产物较在亲本MY11中扩增产物变短，且可能发生条带缺失和增加；Xbarc188在G2中扩增条带发生丢失和增加。这些结果说明，在远缘杂交后代1BL.1RS易位系中，染色体1BL发生变异。

2.2.2 微卫星的变化 40对引物中有13对引物在MY11、白粒黑麦和G1、G2中扩增出差异性条带。其中有4对引物(Xbarc128、Xgwm153、Xgwm582和Xgwm498)在MY11、G2和白粒黑麦中扩增出相同条带，而在G1中扩增出不同的条带，且在G1中部分条带丢失(图3A)；5对引物(Xwmc367、Xwmc51、Xbarc174、Xgwm264和Xgwm131)在1R(1B)代换系(G1)和1BL.1RS易位系(G2)中扩增出相同条带，且与亲本MY11和白粒黑麦不同，在G1和G2中扩增产物量增加和扩增片段增大(图3B)；4对引物(Xbarc181、Xbarc55、Xwmc85和Xbarc302)在MY11、白粒黑麦、G1和G2中扩增出的条带完全不同(图3C)。这些结果表明，在远缘杂交后代1BL.1RS易位系中小麦微卫星可能发生变化。

2.2.3 白粒黑麦1RS的特异引物 40对引物中，只有引物Xbarc8在材料G1(1R(1B)代换系)、G2(1BL.1RS易位系)和白粒黑麦中扩增出相同的条带(图4)，且该条带经多次重复均稳定出现，并且该条带未出现在小麦CS和MY11中(图4)，因此引物Xbarc8可以作为识别和鉴定小麦CS和MY11背景中白粒黑麦1RS染色体臂的特异引物。

3 讨 论

小麦-黑麦1BL.1RS易位系已被广泛应用于小麦育种中，对于1BL.1RS染色体的多样性研究主要集中在1RS染色体臂以及着丝粒区域。苏亚蕊等[6]用11对1RS特异引物对21个1BL.1RS小麦易位系进行扩增，结果显示1RS出现特异带的丢失或增加，并认为这些变化可能是1RS臂碱基发生变化造成的；唐宗祥等[7]用重复序列pSc119.1对姊妹系1BL.1RS易位分析发现，姊妹系之间黑麦特异重复序列pSc119.1发生变化，说明黑麦1RS染色体臂发生结构变化。本研究利用GISH和FISH技术准确鉴定了1BL.1RS易位系和1R(1B)代换系，并利用SSR方法对其进行分析，结果显示，6对引物在MY11、CS及G2中扩增出1BL的条带，在G1和白粒黑麦中未扩增出条带，其中3对引物在1BL.1RS易位系和亲本MY11间扩增出差异性条带，这意味着小麦1BL染色体臂发生了变异。小麦-黑麦远缘杂交、双二倍体形成、外源染色体的进入对1BL染色体臂造成的影响以及长期的栽培等，都是造成小麦-黑麦1BL.1RS易位系中1BL染色体变异的原因。唐宗祥等[21]对小麦-黑麦双二倍体植株及其F1植株进行SSR分析发现，在小麦-黑麦双二倍体形成过程中微卫星未发生长度变异。本试验中，在小麦-黑麦1BL.1RS易位系中，微卫星发生了长度变异以及条带的丢失或增加，这可能是在小麦-黑麦1BL.1RS易位形成过程中或长期栽培过程中造成的，但本试验中1BL染色体臂变异的具体机制还需进一步研究。

远缘杂交是创造新的不同于亲本性状的一种方法。通过对远缘杂交后经人工加倍获得的小麦-黑麦双二倍体及其后代进行遗传多样性研究，可以了解远缘杂交及双二倍体形成过程中基因组、染色体行为及表观遗传学的快速变化[22]。小麦-黑麦远缘杂交组合中，小麦细胞质背景、亲本的亲缘程度、外源染色体附加、基因组大小的不同、染色质组成形式和细胞周期的不同都是造成染色体组变化的原因[23-25]。同时，研究表明在多倍化过程中常常伴随低拷贝、编码和非编码序列的快速丢失，且具有重复性[22,26-27]。Han等[15]报道，种间杂交和小黑麦双二倍体中的染色体组改变发生在较早的时期，随后双二倍体则保持相对稳定的状态，同时DNA水平上的染色体组间的重组可以造成非常有限范围内基因组的变化。在本研究中，40对引物中有13对SSR引物在亲本和后代中扩增出不同的条带，证明在远缘杂交形成易位的过程中，小麦染色体的微卫星也会发生一定变化。在进一步的研究中，如果详细检测不同世代植株染色体的微卫星变异，进行前后代微卫星的比较，就可以揭示微卫星变化的具体原因和机制。

某一物种中的SSR标记常常被成功地应用于其近缘种属中，例如小麦的微卫星被成功地应用于黑麦、大麦、簇毛麦等物种中。Zhang等[28]发现，276对小麦SSR引物中有9对可以作为簇毛麦的特异分子标记。本试验40对SSR引物中，有1对引物(Xbarc8)在白粒黑麦、1R(1B)代换系和1BL.1RS易位系中扩增出特异条带，而小麦CS和MY11中未出现相同的特征带，表明Xbarc8位于白粒黑麦1RS上，且可以作为白粒黑麦1RS染色体的特异引物。田茂洁等[29]发现，在50对普通小麦SSR引物中有3对引物gwm232、gwm260 和gwm644在13种黑麦基因组DNA中扩增出黑麦特异片段，对这些片段进行回收测序，发现该特异片段包含启动子区域；Tang等[30]利用小麦上的150对SSR引物扩增小麦-黑麦附加系及黑麦，只有9对引物扩增出黑麦特异条带。但是这些引物和本试验中的Xbarc8不同，因此引物Xbarc8是白粒黑麦1RS染色体上新的特异引物，为识别和鉴定小麦CS和MY11背景中白粒黑麦1RS染色体臂的特异引物。

[1] Singh R,Tiwari R,Gupta R K,et al.1RS.1BL translocation and grain yield as well as bread loaf volume in Indian wheats [J].Cereal Research Communications,2009,37(3):441-448.

[2] 雷孟平,李光蓉,刘 成,等.抗条锈病的小麦-非洲黑麦异代换系的分子细胞学鉴定 [J].农业生物技术学报,2013,21(3):263-271.

Lei M P,Li G R,Liu C,et al.Molecular cytogenetic characterization of aTriticumdurum-Secaleafricanumsubstitution line for resistance to stripe rust (PucciniastriiformisEriks.f.sp.tritici) [J].Journal of Agricultural Biotechnology,2013,21(3):263-271.(in Chinese )

[3] Chen W Q,Wu L R,Liu T G,et al.Race dynamics,diversity,and virulence evolution inPucciniastriiformisf.sp.tritici,the causal agent of wheat stripe rust in China from 2003 to 2007 [J].Plant Disease,2009,93(11):1093-1101.

[4] Ren T H,Yang Z J,Yan B J,et al.Development and characterization of a new 1BL.1RS translocation line with resistance to stripe rust and powdery mildew of wheat [J].Euphytica,2009,169(2):207-213.

[5] Ren T H,Chen F,Yan B J,et al.Genetic diversity of wheat-rye 1BL.1RS translocation lines derived from different wheat and rye sources [J].Euphytica,2012,183(2):133-146.

[6] 苏亚蕊,张大乐,高安礼,等.小麦1BL/1RS易位系1RS分子标记位点稳定性分析 [J].麦类作物学报,2006,26(6):6-10.

Su Y R,Zhang D L,Gao A L,et al.Analysis on the stability of 1RS in the wheat-rye 1BL/1RS translocation lines [J].Journal of Triticeae Crops,2006,26(6):6-10.(in Chinese)

[7] 唐宗祥,任正隆,符书兰,等.黑麦特异重复序列pSc119.1在姊妹T1 RS.1BL易位系中的变异 [J].遗传,2007,29(2):235-242.

Tang Z X,Ren Z L,Fu S L,et al.Variation of rye-specific repetitive DNA pSc119.1 among sister T1 RS.1BL translocations [J].Hereditas,2007,29(2):235-242.(in Chinese)

[8] Tang Z X,Fu S L,Ren Z L,et al.Characterization of three wheat cultivars possessing new 1BL.1RS wheat-rye translocations [J].Plant Breed,2009,128:524-527.

[9] 王 曦,刘太国,向文胜,等.小麦秆锈菌特异性 SSR分子标记的开发 [J].中国农业科学,2011,44(22):4593-4599.

Wang X,Liu T G,Xiang W S,et al.Development of a SSR molecular marker forPucciniagraminisf.sp.tritici [J].Scientia Agricultura Sinica,2011,44(22):4593-4599.(in Chinese)

[10] 李卫华,刘 伟,尤明山,等.利用多种SSR引物构建小麦遗传连锁图谱及其多态性分析 [J].麦类作物学报,2007,27(1):1-6.

Li W H,Liu W,You M S,et al.Construction of wheat molecular linkage map using different SSR markers and the polymorphism of the markers [J].Journal of Triticeae Crops,2007,27(1):1-6.(in Chinese)

[11] 郭小丽,刘冬成,罗 铮,等.我国部分优质小麦品种遗传差异的SSR标记分析 [J].麦类作物学报,2004,24(1):1-5.

Guo X L,Liu D C,Luo Z,et al.Genetic diversity of some Chinese high quality wheat detected by SSR markers [J].Journal of Triticeae Crops,2004,24(1):1-5.(in Chinese)

[12] 王 瑞,刘红彦,李洪连,等.小麦抗白粉病基因Pm6的PCR标记鉴定 [J].麦类作物学报,2007,27(3):421-424.

Wang R,Liu H Y,Li H L,et al.Identification of PCR markers linked to wheat powdery mildew resistance gene Pm6 [J].Journal of Triticeae Crops,2007,27(3):421-424.(in Chinese)

[13] Zhang M,Wang H,Dong Z,et al.Tissue culture-induced variation at simple sequence repeats in sorghum (SorghumbicolorL.) is genotype-dependent and associated with down-regulated expression of a mismatch repair gene,MLH3 [J].Plant Cell Reports,2010,29(1):51-59.

[14] Feldman M,Levy A A.Genome evolution due to allopolyploi-dization in wheat [J].Genetics,2012,192(3):763-774.

[15] Han F P,Fedak G,Ouellet T,et al.Rapid genomic changes in interspecific and intergeneric hybrids and allopolyploids of triticeae [J].Genome,2003,46(4):716-723.

[16] Vershinin A V,Salina E A,Svitashev S K.Is there a connection between genomic changes and wide hybridization [J].Hereditas,1992,116(3):213-217.

[17] 王变银,翟 军,郝元峰,等.对人工合成小麦的微卫星变异分析 [J].作物学报,2011,37(8):1491-1496.

Wang B Y,Zhai J,Hao Y F,et al.Microsatellite variation in synthetic hexaploid wheat [J].Acta Agronomica Sinica,2011,37(8):1491-1496.(in Chinese)

[18] Zhang H B,Zhao X P,Ding X L,et al.Preparation of megabase-size DNA from plant nuclei [J].The Plant Journal,1995,7(1):175-184.

[19] Han F P,Gao Z,Yu W C,et al.Minichromosome analysis of chromosome pairing,disjunction,and sister chromatid choesion in maize [J].The Plant Cell Online,2007,19(12):3853-3863.

[20] 李 雪.简单重复序列在小麦中的突变机制与抗病应用的初步研究 [D].四川雅安：四川农业大学,2011.

Li X.The study on mutations mechanism of simple repeat sequence and disease resistant application [D].Ya’an,Sichuan:Sichuan Agricultural University,2011.(in Chinese)

[21] 唐宗祥,符书兰,任正隆,等.小麦-黑麦双二倍体形成过程中微卫星序列的变化 [J].麦类作物学报,2008,28(2):197-201.

Tang Z X,Fu S L,Ren Z L,et al.Microsatellite sequence variation of wheat-rye amphiploids detected by SSR markers [J].Journal of Triticeae Crops,2008,28(2):197-201.(in Chinese)

[22] Ozkan H,Levy A A,Feldman M.Allopolyploidy-induced rapid genome evolution in the wheat (Aegilops-Triticum) group [J].The Plant Cell Online,2001,13(8):1735-1747.

[23] Ma X F,Gustafson J P.Timing and rate of genome variation in triticale following allopolyploidization [J].Genome,2006,49(8):950-958.

[24] Bento M,Gustafson P,Viegas W,et al.Genome merger:From sequence rearrangements in triticale to their elimination in wheat-rye addition lines [J].Theoretical and Applied Genetics,2010,121(3):489-497.

[25] Fu S L,Sun C F,Yang M Y,et al.Genetic and epigenetic variations induced by wheat-rye 2R and 5R monosomic addition lines [J].PLoS ONE,2013,8(1):e54057.

[26] Ma X F,Fang P,Gustafson J P.Polyploidization-induced genome variation in triticale [J].Genome,2004,47(5):839-848.

[27] Feldman M,Liu B,Segal G,et al.Rapid elimination of low-copy DNA sequences in polyploidy wheat:A possible mechanism for differentiation of homoeologous chromosomes [J].Genetics,1997,147(3):1381-1387.

[28] Zhang W,Gao A L,Zhou B,et al.Screening and applying wh-eat microsatellite markers to trace individualHaynaldiavillosachromosomes [J].Acta Genetica Sinica,2006,33(3):236-243.

[29] 田茂洁,唐宗祥.利用小麦微卫星引物建立黑麦特异标记及其局限性 [J].西华师范大学学报:自然科学版,2009,30(1):17-20.

Tian M J,Tang Z X.The development and limitation of rye-specific markers using wheat SSR markers [J].Journal of China West Normal University:Natural Sciences,2009,30(1):17-20.(in Chinese)

[30] Tang Z X,Fu S L,Ren Z L,et al.Variations of tandem repeat,regulatory element,and promoter regions revealed by wheat-rye amphiploids [J].Genome,2008,51(6):399-408.

Variation of 1BL chromosome arm in wheat-rye translocation line 1BL.1RS

GE Qun,LI Wen-jing,REN Tian-heng,LI Zhi,REN Zheng-long

(AgronomyCollege，SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】 The study analyzed the variation of 1BL chromosome arm in wheat-rye translocation line 1BL.1RS to provide theoretical basis for further application of 1BL.1RS in wheat breeding.【Method】 Two wheat lines,G1 and G2,originated from the cross of wheat cultivar Mianyang 11 (MY11) and rye were identified using GISH and FISH. G1 was a 1R(1B) substitution line and G2 was a 1BL.1RS translocation line.40 markers of wheat 1B chromosome were selected to amplify the genome DNA of the parents MY11,rye,G1,G2 and common wheat Chinese spring (CS) for SSR analysis.【Result】 Among the 40 pairs,6 pairs of primers had amplified bands of 1BL in MY11,CS and G2,while no bands for G1 and rye, and 3 markers (Xgwm259,Xbarc188,and Xgwm268) exhibited different bands between the parents MY11 and translocation line G2,indicating that the variation of the 1BL chromosome arm occurred in formation of 1BL.1RS translocation.There were 13 out of 40 markers had different bands between the parents,G1 and G2,suggesting the variation of microsatellites progeny of wheat-rye hybrid.Marker Xbarc8 amplified the 1RS specific bands,and the band was stable,so it can be used as molecular marker to identify the 1RS chromosome.【Conclusion】 The variation of 1BL chromosome arm in wheat-rye translocation line 1BL.1RS was confirmed.Xbarc8 can be used as molecular marker to identify the 1RS chromosome.

wheat;rye;1BL.1RS translocation line;1R(1B) substitution line;microsatellite

2014-01-06

国家自然科学基金项目(31271722)

葛 群(1989-)，男，安徽宿州人，在读硕士，主要从事植物分子细胞遗传学研究。E-mail:gejiaoyu@163.com

任正隆(1949-)，男，四川成都人，教授，博士生导师，主要从事植物分子细胞遗传学研究。 E-mail:renzllab@sicau.edu.cn

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.025

S512.1；S330

A

1671-9387(2015)06-0073-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.025.html