郝凤奇,李景梅,杨洲红

(长春理工大学 生命科学技术学院,吉林 长春 130022)

表达EPEC紧密素蛋白重组嗜酸乳酸杆菌的免疫效果检测

郝凤奇,李景梅,杨洲红

(长春理工大学 生命科学技术学院,吉林 长春 130022)

【目的】 制备抗肠致病性大肠杆菌(EPEC)的重组嗜酸乳酸杆菌，并初步探索其免疫效果。【方法】 采用DNAStar软件选取EPEC E2348/69的eae全基因中抗原性较高的984 bp片段(编码328个氨基酸残基，命名为eaeInt328)为目标序列，以EPEC E2348/69基因组为模板，PCR扩增eaeInt328基因，构建重组表达载体pSIP409-eae Int328，电转化法获得相应的重组嗜酸乳酸杆菌，采用SppIP诱导重组菌表达，并通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定重组蛋白。以BALB/c雌性小鼠为受试动物，灌胃重组嗜酸乳酸杆菌15 d后，再灌胃EPEC，第21天，取结肠PP结和肠内容物，15和21 d称体质量，同时设PBS(对照)、EPEC和pSIP409空载体转化嗜酸乳酸杆菌处理。采用流式细胞术检测结肠PP结中的CD11c+DC、CD4+T、CD19+B细胞比例，采用ELISA检测肠内容物中的特异性sIgA水平。【结果】 克隆得到了984 bp的eaeInt328基因，构建了重组质粒pSIP409-eae Int328，制备了相应的重组嗜酸乳酸杆菌，用SppIP诱导表达后，重组嗜酸乳酸杆菌表达了分子质量约为36 ku的重组蛋白，该重组蛋白与eae单克隆抗体可发生特异性结合。与EPEC和pSIP409空载体转化嗜酸乳酸杆菌组相比，21 d时，pSIP409重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠体质量显著增加，且与PBS组小鼠无显著差异。该重组嗜酸乳酸杆菌可显著提高BALB/c小鼠结肠PP结中的CD19+B细胞比例，极显著提高结肠PP结中的CD11c+DC和CD4+T细胞比例，使肠道黏膜产生针对EPEC的特异性sIgA。【结论】 pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌通过CD11c+DC的介导，促进CD4+T细胞数量增加，进而诱导B细胞活化产生针对EPEC的特异性sIgA，进而对小鼠EPEC的急性感染发挥作用。

肠致病性大肠杆菌；eae基因；重组嗜酸乳酸杆菌

肠致病性大肠杆菌(EnteropathogenicEscherichiacoli,EPEC)是引起5岁以下儿童细菌性腹泻暴发和散发的重要病原微生物，每年可导致数以千计的婴幼儿死亡[1]，也是引起幼龄动物细菌性腹泻的重要原因。EPEC 的主要致病机制是粘附与脱落(A/E)[2]，主要由eae基因编码的紧密素所引起，eae基因突变菌株则失去紧密粘附于上皮细胞的能力，不能产生A/E损伤[3]。此外，紧密素也是良好的候选抗原，可用于EPEC疫苗的研制[4]。

乳酸杆菌是人和动物消化道内的共生菌，可作为肠道功能性蛋白递送的活载体。近年来，表达功能性蛋白重组乳酸杆菌的研究方兴未艾，如表达弹性蛋白酶抑制剂(Elafin)用于改善肠道炎症、表达超氧化物歧化酶(SOD)用于清除氧自由基、表达白细胞介素10(IL-10)等细胞因子用于调节肠道黏膜免疫及表达抗原蛋白用于产生特异性保护抗体[5]等。笔者的前期研究证实，嗜酸乳酸杆菌具有黏膜免疫调节作用[6]，本试验在此基础上，采用重组DNA技术构建了携带EPEC E2348/69部分eae基因的乳酸杆菌重组表达质粒pSIP409-eae Int328，制备了相应的重组嗜酸乳酸杆菌，并通过小鼠体内试验，初步探索了该重组基因工程菌的免疫效果，旨在为深入研究抗EPEC的重组乳酸杆菌微生态制剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株 嗜酸乳酸杆菌、大肠杆菌(E.coli)DH5α、肠致病性大肠杆菌E2348/69由长春理工大学生命科学技术学院微生物学实验室保存。

1.1.2 质粒载体 pMD18T克隆质粒载体，购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒表达载体pSIP409、SppIP诱导肽由吉林农业大学王春凤教授惠赠。

1.1.3 主要试剂 RPMI 1640培养基，购自Gibco公司；Anti-mouseCD11c-FITC、Anti-mouseCD4-PE、Anti-mouseCD19-APC单克隆抗体和FACS Buffer，购自BD公司；HRP 标记的羊抗鼠IgG、IgA，购自美国Santa Cruz公司；ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、NcoⅠ、Hind Ⅲ限制性内切酶和dNTP mix，购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；EDTA，购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；丝氨酸蛋白酶抑制剂，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.4 试验动物 BALB/c雌性小鼠，40只，体质量18～22 g/只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 EPECeaeInt328基因的选择及引物设计 根据GenBank登录的EPEC E2348/69毒力岛基因座(GenBank登录号：AF022236.1)中eae基因的序列，采用DNAStar软件分析其抗原指数，确定其开放阅读框中24 921至25 904 位间长度为984 bp的片段为目标序列，采用Primer 5.0软件设计上、下游引物，并引入NcoⅠ、Hind Ⅲ酶切位点和TAA终止密码子。引物序列为：上游引物(F)5′-CCATGGCTGGTTTAGGATTGTT-3′，下划线部分为NcoⅠ酶切位点；下游引物(R) 5′-GGAAGCTTTTACTGCTCATACATCA-3′，下划线部分为Hind Ⅲ酶切位点。

1.2.2 EPECeaeInt328基因的克隆 采用细菌基因组DNA提取试剂盒，按照说明书操作提取EPEC E2348/69基因组。PCR反应体系50 μL：10×ExTaqBuffer 5.0 μL，dNTP mix 4.0 μL，上下游引物各1.0 μL，EPEC E2348/69基因组模板0.5 μL，ExTaq酶0.5 μL，双蒸水38.0 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃再延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，采用DNA凝胶纯化试剂盒回收，与pMD18T质粒载体连接，获得pMD18T-eae Int328，将其转化至大肠杆菌(E.coli)DH5α，经含100 μg/mL氨苄青霉素(AMP)的LB平板筛选，挑取2个阳性转化子进行扩大培养，提取质粒，进行NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切检测，并送至生工生物(上海)工程有限公司测序。

1.2.3 pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌的制备 将pSIP409和pMD18T-eae Int328分别进行NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切，回收目的片段后用T4 DNA酶进行连接，获得pSIP409-eae Int328，将其电转化至嗜酸乳酸杆菌[7]，经含200 μg/mL红霉素(EM)的LB平板筛选，挑取2个阳性转化子进行扩大培养，提取质粒，进行NcoⅠ 和Hind Ⅲ双酶切检测。

1.2.4 pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌的诱导表达 将双酶切鉴定正确的pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌培养液转接到100 mL MRS培养基中，其中菌液与培养基的体积比为1∶50，37 ℃厌氧培养至菌液OD600为0.6时，加入终质量浓度为50 ng/mL的SppIP诱导肽，诱导表达4 h后，产物于4 ℃下12 000 r/min离心，收集菌体，菌体用PBS洗涤2次，加40 μL 1×上样缓冲液和10 μL DTT，煮沸10 min，进行SDS-PAGE检测，以转化pSIP409的嗜酸乳酸杆菌为对照。同时对表达产物进行常规Western-blot检测，简言之，将转印好表达产物的硝酸纤维素膜置于含30 g/L BSA PBS的平皿中，室温下振荡封闭2 h，弃去封闭液，加入鼠源eae单克隆抗体的细胞培养上清(体积比1∶100稀释)，室温下孵育2 h，用PBS清洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(体积比1∶5 000稀释)，室温孵育2 h，用PBS清洗3次，加入DAB显色液于室温下缓慢振荡。

1.2.5 菌液制备 将pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌、pSIP409嗜酸乳酸杆菌，分别采用MRS培养基于37 ℃厌氧培养至菌液OD600为0.6～0.8时，4 ℃、6 000 r/min离心2 min，菌体沉淀用1×PBS(pH7.4)清洗3次后，配制成108CFU/mL的菌体悬液。EPEC(E2348/69)采用LB培养基，于37 ℃下，150 r/min摇床培养，配制成108CFU/mL的菌体悬液。

1.2.6 试验动物分组及处理 试验小鼠平均分成4组(PBS组、EPEC组、pSIP409嗜酸乳酸杆菌组和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组)，清洁级饲养，自由饮水和采食，12 h光照，12 h黑暗，试验期21 d。试验期内，pSIP409嗜酸乳酸杆菌组和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠分别灌胃相应菌体悬液1 mL/(只·d)，PBS组和EPEC组灌胃等体积的PBS。第15天，除PBS组外，其余3组灌胃EPEC菌体悬液1 mL/(只·d)。第21天，颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，取结肠PP结和肠内容物备检。试验15和21 d清晨饲喂前称体质量。

1.2.7 结肠PP结细胞悬液的制备 将结肠PP结置于盛放有RPMI 1640培养基的平皿中，注射器末端研磨后，过无菌筛网制成细胞悬液，4 ℃下2 000 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀用1×PBS洗涤2次，加入适量RPMI 1640培养基计数。

1.2.8 流式细胞仪检测 取1.2.7制备的细胞悬液200 μL，加入2.0 mL FACS Buffer，1 500 r/min离心5 min，弃上清，细胞沉淀用1×PBS洗涤2次。细胞用FACS Buffer混匀，加入到Tube管中，调整细胞数量为106/管，每管加入10 μL荧光标记抗体，CD11c+树突细胞(CD11c+DC)、CD4+T细胞(CD4+T)、CD19+B细胞(CD19+B)比例检测分别采用Anti-mouseCD11c-FITC、Anti-mouseCD4-PE、Anti-mouseCD19-APC单克隆抗体，4 ℃避光作用30 min，FACS Buffer洗涤2次，最后溶于100 μL FACS Buffer 中，加入10 μL多聚甲醛固定，进行流式细胞仪检测。

1.2.9 肠道中特异性分泌型IgA(sIgA)的检测 小鼠肠内容物按每100 mg加入500 μL PBS(pH7.0)，制成匀浆，4 ℃静置20 min，加入终浓度为 0.05 mol/L EDTA和1 mmol/L 丝氨酸蛋白酶抑制剂，于4 ℃下10 000 r/min离心40 min，取上清液备用，用ELISA法检测特异性sIgA水平，简言之，EPEC过夜培养物经超声破碎，用包被液1∶20倍稀释后取100 μL包被酶标板(于4 ℃下包被过夜)，次日洗涤后用100 g/L的BSA 封闭，每孔加入体积比1∶5稀释的肠内容物100 μL，于37 ℃下孵育3 h，以PBS作空白对照，洗涤后每孔加入 HRP 标记的羊抗鼠IgA(体积比1∶5 000稀释)100 μL，于37 ℃下孵育1.5 h，洗涤后每孔加入显色底物溶液100 μL，室温避光显色10 min，每孔加50 μL终止液终止反应，酶标仪490 nm波长读取吸光度值。

1.3 数据统计与分析

采用Graphpad Prism 6.0对数据进行统计分析并作图，结果用“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 EPEC eae Int328基因的克隆

由图1可知，以EPEC E2348/69基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到了eaeInt328基因片段，该片段含编码序列、上下游酶切位点、保护性碱基和终止密码子共1 000 bp，其中编码序列984 bp。由图2可知，NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切重组克隆质粒pMD18T-eae Int328获得了与理论值相符的载体基因片段和eaeInt328基因片段。测序结果表明，克隆的eaeInt328基因序列与GenBank登录的模板序列(GenBank登录号：AF022236.1)相似性为100%。

2.2 pSIP409-eae Int328重组表达质粒的鉴定

由图3可知，NcoⅠ和Hind Ⅲ双酶切重组表达质粒载体pSIP409-eae Int328，获得了与理论值相符的载体基因片段和eaeInt328基因片段。

2.3 重组嗜酸乳酸杆菌表达产物的检测

由图4可知，与pSIP409转化的嗜酸乳酸杆菌相比，pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌表达了分子质量约为36 ku的重组蛋白。由图5可知，该重组蛋白能够与eae单克隆抗体特异性结合。

2.4 重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠体质量的影响

试验第15和21天，分别称量小鼠体质量，结果如表1所示。由表1可见，试验15 d，各组小鼠体质量无显著差异(P>0.05)；试验21 d，与PBS组相比，EPEC组和pSIP409转化的嗜酸乳酸杆菌组小鼠体质量显著降低(P<0.05)；与EPEC组和pSIP409转化的嗜酸乳酸杆菌组相比，pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠体质量显著增加(P<0.05)，并且与PBS组相比无显著差异(P>0.05)。

注：同列数据后标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Same lowercase letters in each column indicate insignificant difference (P>0.05),different letters indicate significant difference (P<0.05).

2.5 重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠结肠PP结中CD11c+ DC比例的影响

重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠结肠PP结中CD11c+DC比例的影响见图6。由图6可知，PBS组、EPEC组、pSIP409嗜酸乳酸杆菌组、pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠结肠PP结中CD11c+DC细胞比例分别为(33.18±0.63)%，(36.30±0.83)%，(39.09±0.57)%和(39.39±0.52)%。与PBS相比，EPEC显著提高了CD11c+DC细胞比例(P<0.05)，而pSIP409嗜酸乳酸杆菌和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌均极显著提高了CD11c+DC细胞比例(P<0.01)。与EPEC相比，pSIP409嗜酸乳酸杆菌和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌均显著提高了CD11c+DC细胞比例(P<0.05)。

2.6 重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠结肠PP结中CD4+ T细胞比例的影响

由图7可知，PBS组、EPEC组、pSIP409嗜酸乳酸杆菌组、pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠结肠PP结中CD4+T细胞比例分别为(34.68±1.29)%，(34.74±1.69)%，(42.60±1.30)%和(42.61±0.92)%。与PBS和EPEC相比，pSIP409嗜酸乳酸杆菌和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌均极显著提高了CD4+T细胞比例(P<0.01)。

2.7 重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠结肠PP结中CD19+ B细胞比例的影响

由图8所知，PBS组、EPEC组、pSIP409嗜酸乳酸杆菌组、pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠结肠PP结中CD19+B细胞比例分别为(21.95±1.23)%，(22.05±1.35)%，(21.40±0.36)%，(26.77±1.00)%。与PBS、EPEC和pSIP409嗜酸乳酸杆菌相比，pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌显著提高了CD19+B细胞比例(P<0.05)。

2.8 重组嗜酸乳酸杆菌对肠道中特异性sIgA水平的影响

由图9所知，EPEC组、pSIP409嗜酸乳酸杆菌组、pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌组小鼠肠道内容物中特异性sIgA的吸光度值分别为0.53±0.04，0.54±0.06，1.34±0.04,与PBS相比，均极显著增加了特异性sIgA的水平。与EPEC和pSIP490嗜酸乳酸杆菌相比，pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌极显著增加了特异性sIgA的水平(P<0.01)。

图6 pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠结肠PP结中CD11c+DC细胞比例的影响柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。下图同
Fig.6 Ratio of CD11c+DC in colon PP influenced by pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilusDifferent lowercase letters indicate significant difference (P<0.05),different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01).The same below

图7 pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠结肠PP结中CD4+T细胞比例的影响
Fig.7 Ratio of CD4+T in colon PP influenced by pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus

图9 pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌对小鼠肠道中特异性sIgA水平的影响
Fig.9 Intestinal specific sIgA titers influenced by pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus

3 讨 论

eae基因位于LEE 致病岛，核苷酸序列分析表明，EPEC E2384/69 的eae基因含有长2 817 bp的开放阅读框，编码一个含939个氨基酸残基的蛋白质分子，称之为紧密素蛋白，其相对分子质量102.4 ku[8]。含eae基因的EPEC能够引起肠黏膜出现典型的A/E损伤病变[9]。研究表明，EPEC感染后能够在体内检测到抗紧密素蛋白抗体，紧密素免疫反应能够抵抗紧密素蛋白阳性EPEC的感染，说明紧密素是一种保护性抗原[4]。然而，eae全基因较大，不适合作为重组抗原的候选基因。本试验采用DNAStar软件，分析了eae全基因的抗原性指数(Jameson-Wolf法)，结合表达载体pSIP409的酶切位点，选择了编码328个氨基酸残基的核苷酸序列(984 bp)作为靶基因，构建了乳酸菌重组表达载体pSIP409-eae Int328。

结肠PP结是分布在结肠组织中的次级淋巴器官，富含树突细胞(DC)、巨噬细胞(Mφ)及T、B细胞，是结肠组织发挥局部黏膜免疫应答的主要场所[10]。

DC是重要的抗原递呈细胞，在介导先天免疫和获得性免疫中具有重要作用，CD11c+DC是小鼠成熟的DC(mDC)，具有典型的抗原递呈功能，通过给予Naïve T细胞TCR和共刺激分子信号诱导其分化为效应性CD4+T细胞[11]。乳酸杆菌能够通过其表面微生物相关分子识别模式(如肽聚糖、磷壁酸、S-层蛋白等)与DCs表面模式识别受体(如TLR、CLR等)相结合，引发下游免疫级联信号，调控DC功能[12]。本试验中pSIP409嗜酸乳酸杆菌和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌均极显著提高了结肠PP结中CD11c+DC比例，而这2组间无显著差异，表明嗜酸乳酸杆菌能够增强DC的抗原递呈功能。尽管EPEC单独灌胃也显著提高了结肠PP结中CD11c+DC比例，但是显著低于pSIP409嗜酸乳酸杆菌和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌，表明DC在病原微生物感染的状态下也趋近成熟。

CD4+T细胞是辅助性T细胞亚群，是广泛存在于机体的效应性T细胞，在介导机体细胞免疫和体液免疫方面发挥重要作用。本试验中，pSIP409嗜酸乳酸杆菌和pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌均极显著提高了结肠PP结中CD4+T细胞比例，而这2组间无显著差异，结合对CD11c+DC比例的影响结果，推测嗜酸乳酸杆菌可能通过CD11c+DC的介导，促进了CD4+T细胞的数量增加，尤其是pSIP409-eae Int328重组嗜酸乳酸杆菌进一步通过该途径活化了B细胞，产生了针对EPEC的特异性sIgA。

乳酸杆菌作为人和动物消化道中的益生菌，具有帮助消化、调节免疫的特性。本课题组前期的研究表明，嗜酸乳酸杆菌能够显著上调Th1和Th2型免疫反应，显著提高肠道黏膜sIgA水平[6]。本试验在该嗜酸乳酸杆菌本身的免疫调节功能基础上，采用重组DNA技术制备了表达EPEC紧密素抗原蛋白的重组嗜酸乳酸杆菌，经小鼠体内研究证实，该重组嗜酸乳酸杆菌对EPEC的感染具有一定的保护作用，为深入开发抗EPEC的重组乳酸杆菌微生态制剂提供了有价值的参考。然而，本试验只检测了重组嗜酸乳酸杆菌对PP结中DC的活化功能，鉴于PP结中M细胞和Mφ在抗原递呈和免疫调控方面也具有一定作用[13-14]，因此对于嗜酸乳酸杆菌或重组嗜酸乳酸杆菌是否增强了这2类细胞的功能，值得进一步探讨。

[1] Kaper J B,Nataro J P,Mobley H L.PathogenicEscherichiacoli[J].Nature Reviews Microbiology,2004,2(2):123-140.

[2] Chen H D,Frankel G.EnteropathogenicEscherichiacoli:Unravelling pathogenesis [J].Fems Microbiology Reviews,2005,29(1):83-98.

[3] Donnenberg M S,Tzipori S,McKee M L,et al.The role of the eae gene of enterohemorrhagicEscherichiacoliin intimate attachmentinvitroand in a porcine mode [J].Journal of Clinical Investigation,1993,92(3):1418-1424.

[4] 陈 萍,刘景圣,冯书章.eae基因及其编码的紧密素研究进展 [J].中国人兽共患病学报,2007,23(5):515-517.

Chen P,Liu J S,Feng S Z.Progress ofeaegene and intimin [J].Chinese Journal of Zoonoses,2007,23(5):515-517.(in Chinese)

[5] Bermúdez-Humarán L G,Aubry C,Motta J P,et al.Engineering lactococci and lactobacilli for human health [J].Current Opinion in Microbiology,2013,16(3):278-283.

[6] 郝凤奇,李景梅,李成玉,等.2种乳酸杆菌肠道黏膜免疫调节作用的比较 [J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2014,42(10):29-34.

Hao F Q,Li J M,Li C Y,et al.Comparison of the intestinal mucosal immuneregulation functions of twoLactobacillusstrains [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2014,42(10):29-34.(in Chinese)[7] 郝凤奇,李景梅,杨桂连.乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定 [J].中国预防兽医学报,2012(8):624-628.

Hao F Q,Li J M,Yang G L.Construction and application of Nisin-controlled expressionplasmid forLactococcusacidophilus[J].Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine,2012(8):624-628.(in Chinese)

[8] Frankel G,Candy D C,Everest P,et al.Characterization of the C-terminal domains of intimin-like proteins of enteropathogenic and enterohemorrhagicEscherichiacoli,Citrobacterfreundii,andHafniaalvei[J].Infection and Immunity,1994,62(5):1835-1842.

[9] 孙 晖,赵爱兰,白向宁,等.不同来源肠致病性大肠杆菌(EPEC)分离株eae基因分析 [J].实用预防医学,2014,21(7):773-776.

Sun H,Zhao A L,Bai X N,et al.Typing of intimin (eae) genes from enteropathogenicEscherichiacolistrains isolated from human beings and different animal species [J].Practical Preventive Medicine,2014,21(7):773-776.(in Chinese)

[10] Murphy,Kenneth.Immunobiology [M].7th ed.New York,America:Garland Science,Taylor & Francis Group,2008:462-464.

[11] Shortman K,Liu Y J.Mouse and human dendritic cell subtypes [J].Nature Reviews Immunology,2002,2(3):151-161.

[12] van Baarlen P,Wells J M,Kleerebezem M.Regulation of intestinal homeostasis and immunity with probiotic lactobacilli [J].Trends in Immunology,2013,34(5):208-215.

[13] Craig L M,Charles O E,Robin D H,et al.Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system [J].Nature,2012,489:231-241.

[14] Richman L K,Graeff A S,Strober W.Antigen presentation by macrophage-enriched cells from the mouse Peyer’s patch [J].Cellular Immunology,1981,62(1):110-118.

Detecting immune efficacy of recombinantLactobacillusacidophilusexpressing enteropathogenicEscherichiacoli

HAO Feng-qi,LI Jing-mei,YANG Zhou-hong

(SchoolofLifeScience&Technology,ChangchunUniversityofScience&Technology,Changchun,Jilin130022,China)

【Objective】 This study prepared anti-EPEC recombinantLactobacillusacidophilusand determined its immune efficacy.【Method】 DNAStar software was used to select the 984 bp fragment (encoding 328 aa) with high antigen index from EPEC E2348/69.eaeInt328 gene was amplified by PCR using genome DNA of EPEC E2348/69 as template,and was inserted into plasmid pSIP409 to construct plasmid pSIP409-eae Int328.Then recombinantLactobacillusacidophiluswas obtained using electro-transformation.The recombinant protein was expressed with induction of SppIP,and identified by SDS-PAGE and Western-blot.Fifteen days after intragastric administration of pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus,EPEC was also administrated to BALB/c mice.On the 21st day,mice were killed,and CD11c+DC,CD4+T cell,and CD19+B cells in colon Peyer’s patch and specific sIgA level in intestine were detected using Flow cytometry and ELISA,respectively.【Result】 TheeaeInt328 gene with length of 984 bp was amplified,and the recombinant plasmid pSIP409-eae Int328 was constructed successfully.The pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophiluswas successfully prepared and the recombinant protein with 36 ku was expressed after SppIP induction and its capacity of specific binding to eae monoclonal antibody was confirmed.The pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilusincreased the ratios of CD11c+DC,CD4+T cell,and CD19+B cell in colon Peyer’ patch.The specific sIgA against EPEC in intestine was produced by stimulation of pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophilus.【Conclusion】 The pSIP409-eae Int328 recombinantLactobacillusacidophiluspromoted CD4+T cell expansion through the mediation of CD11c+DC,and further induced activation of B cell to produce sIgA against EPEC,which prevented mice from EPEC acute infection.

EPEC;eaegene;recombinantLactobacillusacidophilus

2015-03-12

吉林省科技发展计划项目(20090246，201101004)

郝凤奇(1981-)，男，吉林长春人，讲师，硕士，主要从事微生物与免疫学研究。E-mail:hao4269@126.com

李景梅(1969-)，女，吉林长春人，教授，博士，硕士生导师，主要从事微生物学研究。E-mail:ljm3023@126.com

时间:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.003

Q939.91

A

1671-9387(2015)06-0028-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.003.html