赵 朴，苏红辽，刘兴友，赵 坤，胡建和，王三虎，姚四新，郑玉姝

(1 河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡 453003；2 动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心，河南 新乡 453003；3 滑县动物卫生监督所，河南 安阳 456400)

NS1基因主要抗原区的可溶性表达及其Dot-ELISA检测方法的建立

赵 朴1,2，苏红辽3，刘兴友1,2，赵 坤1,2，胡建和1,2，王三虎1,2，姚四新1,2，郑玉姝1,2

(1 河南科技学院 动物科学学院，河南 新乡 453003；2 动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心，河南 新乡 453003；3 滑县动物卫生监督所，河南 安阳 456400)

【目的】 可溶性表达猪流感病毒(SIV)NS1基因主要抗原区(NS1′)蛋白，获得具有良好抗原性的NS1′蛋白，并初步建立检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)方法，为鉴别诊断猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪奠定基础。【方法】 以质粒pET28a-NS1为模板，PCR扩增NS1基因抗原性较好的区段NS1′，用EcoRⅠ和XhoⅠ 双酶切后插入pET-32a(+)，构建pET32a-NS1′，经PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定后，转化大肠杆菌Rosetta，用IPTG诱导表达，纯化NS1′并免疫家兔制备多克隆血清，对其进行SDS-PAGE、Western blotting 检测和免疫荧光分析，并以纯化的NS1′作为包被抗原初步建立Dot-ELISA检测方法。【结果】 PCR扩增获得了长约250 bp的H3N2 SIVNS1′片段；成功构建了重组载体pET32a-NS1′；SDS-PAGE 和 Western blotting 检测结果显示，融合蛋白NS1′大小约34 ku，该蛋白可溶，能与感染SIV的猪血清特异性反应，并且用纯化蛋白NS1′制备的多克隆血清能识别293T细胞中表达的NS1，建立的Dot-ELISA检测方法可鉴别猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪。【结论】 实现了H3N2 SIV NS1′蛋白的可溶性表达，表达产物具有良好的抗原性，以NS1′作为包被抗原，建立了检测NS1抗体的Dot-ELISA方法。

猪流感病毒；非结构蛋白1；主要抗原区域；可溶性表达；斑点酶联免疫吸附试验

猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)不仅是猪呼吸系统综合征的重要病原体，给养猪业造成了重大的经济损失，而且严重威胁人类健康[1-4]。2009年H1N1 猪流感病毒引发的流感大流行[5]再次警示人们，控制猪流感即是从源头上控制人流感。因此，监测猪群中流行流感病毒的情况显得尤为迫切，而建立能够鉴别猪流感人工免疫与猪流感病毒感染的诊断方法是有效监测的前提。

A型流感病毒非结构蛋白1(Nonstructural protein 1，NS1)是A型流感病毒重要的毒力因子[6-8]，仅在流感病毒感染过程中表达，因此猪流感灭活疫苗免疫猪对NS1的抗体呈阴性，而SIV感染猪的NS1抗体呈阳性。另外，NS1是H3N2 SIV 毒力基因，其缺失后可使病毒毒力大大降低，用缺失NS1基因的H3N2 SIV鼻内免疫猪，可针对H3N2 SIV(包括抗原变异株)攻毒产生很好的保护作用，对异型H1N1病毒攻毒也可产生部分保护作用[9-10]，并且免疫猪不产生NS1抗体[11]。因此，检测NS1抗体，能够区分流感疫苗免疫猪(包括灭活疫苗和NS1缺失突变弱毒苗)和流感病毒自然感染猪。

本课题组先前已经表达了H3N2 SIV 河南分离株NS1基因[12]，但表达产物存在于包涵体中，变性与复性耗时费力，并且蛋白大量析出，不便于获得大量具有活性的NS1蛋白。为获得可溶性NS1蛋白，本研究分析了NS1的主要抗原区域(NS1′)，并进行克隆、表达，获得了NS1′蛋白，SDS-PAGE、Western blotting 和间接免疫荧光表明，表达的蛋白能够与SIV 感染猪血清发生特异性反应，具有良好的抗原性，并以纯化的NS1′作为包被抗原初步建立了检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌毒株、质粒、细胞和试验动物 受体菌Rosetta、293T细胞、载体pET-32a(+)和pcDNA3.1均由动物疫病和残留物防控河南省高校工程技术研究中心保存；含SIV A/swine/Henan/2/2008(H3N2)NS1基因的pET28a-NS1和pcDNA3.1-NS1载体由河南科技学院动物科学学院中心实验室构建并保存；普通级健康成年雌性新西兰兔2只购自河南新乡医学院实验动物中心。

1.1.2 试 剂TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ和XhoⅠ 内切酶及DNA小量胶回收试剂盒，购自Takara 公司；T4 DNA连接酶和Lipofectamine 2000，购自Invitrogen公司；HRP标记羊抗猪IgG，购自Abcam公司；Immobilon ECL发光液，购自Millipore公司；Thermo Scientific BCA蛋白定量试剂盒，购自赛默飞世尔科技公司；弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂，购自Sigma公司；SIV感染猪血清，采自A/swine/Henan/2/2008(H3N2)分离猪场的感染康复猪，-80 ℃冻存。

1.1.3 引物设计与合成 根据A/swine/Henan/2/2008(H3N2)NS1基因序列，利用primer5.0设计1对扩增NS1′的引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列为(下划线分别为EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点)：上游引物5′-CTCGAATTCATGGATTCCAACACTGTGTCAAG-3′，下游引物5′-ATACTCGAGTCATTAGGAGGCCATGGTC-ATTTTAAGTG-3′。

1.2 NS1′基因的PCR扩增

反应体系为50 μL:10×TaqDNA聚合酶缓冲液5 μL，100倍稀释的pET28a-NS1质粒1 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，20 pmol/L上、下游引物各1.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，灭菌去离子水补足50 μL；反应条件是95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。以质粒pET28a-NS1为模板，在PTC-100基因扩增仪上扩增。取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，凝胶成像仪检查扩增结果。

1.3 pET32a-NS1′的构建及鉴定

将NS1′基因PCR产物纯化，经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后切胶回收，与经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切并胶回收的表达载体pET-32a(+)连接，连接体系为：NS1′基因3 μL,pET-32a(+) 1 μL，5×T4 DNA连接酶缓冲液2 μL，T4 DNA连接酶1 μL，灭菌去离子水补足10 μL，16 ℃过夜。将连接产物转化入受体菌Rosetta，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上,37 ℃培养14～16 h，挑取单个菌落，培养后进行PCR鉴定，并提取质粒进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定，阳性重组质粒命名为pET32a-NS1′。将阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。NCBI BLAST分析测序结果。

1.4 pET32a-NS1′的诱导表达

分别挑取转化表达载体pET-32a(+)和pET32a-NS1′的Rosetta，接种于含100 μg/mL Amp的LB培养基上，37 ℃振摇培养至A600为 0.5～0.6，然后按1∶100的体积比加入含有Amp (100 μg/mL)的LB液体培养基，37 ℃振荡培养2～3 h(A600为0.5～0.6)，加入0.1 mol/L IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，37 ℃继续振摇培养5 h，吸取诱导表达产物备用。

1.5 重组蛋白NS1′的SDS-PAGE和Western blotting检测

1.5.1 SDS-PAGE检测 将1.4中的诱导培养物，于4 ℃下 5 000 r/min离心10 min，收集诱导表达菌体，PBS洗涤3次，用1/10菌液体积的PBS重悬菌体，冰浴超声5次(10 s/次)裂解菌体，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min ，分别收集上清和沉淀，12%SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性，用考马斯亮蓝染色液染色，脱色，检测表达蛋白。同时设未诱导的pET32a-NS1′及诱导的pET-32a(+)为对照。

1.5.2 Western blotting检测 利用Western blotting技术检测表达产物的反应原性。利用伯乐半干式电转仪于15 V下电转30 min，将SDS-PAGE凝胶中的蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC)，50 g/L脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，PBST洗涤5次，将SIV感染猪血清(1∶100稀释)37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次，加入1∶3 000稀释的HRP标记羊抗猪IgG，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次。暗室内，将保鲜膜紧密铺于暗盒，蛋白面朝上放入洗涤好的NC膜，均匀涂上ECL发光液，折回保鲜膜覆盖NC膜，再将X胶片放于NC膜上，盖紧暗盒，曝光10～15 min，取出X胶片，经显影-水洗-定影，晾干，保存结果。同时设未诱导的pET32a-NS1′及诱导的pET-32a(+)为对照。

1.6 NS1′免疫血清的制备

镍柱亲和纯化NS1′，按Thermo Scientific BCA蛋白定量试剂盒操作说明，采用BCA法测定纯化的NS1′蛋白质量浓度为0.26 μg/mL，超滤管浓缩至1.53 μg/mL。将600 μL纯化蛋白溶液(含600 μg蛋白)与等体积弗氏完全佐剂混合，乳化，多点背部皮内、皮下免疫健康成年新西兰兔2只，400 μL/只，21 d后，用弗氏不完全佐剂制备疫苗(方法同弗氏完全佐剂)，400 μL/只加强免疫，21 d后耳缘静脉采血，琼脂扩散试验测定效价，当效价达1∶32时(如达不到，再次加强免疫)，心脏采血，分离血清，分装，-20 ℃冻存。

1.7 NS1′免疫血清的有效性

用96孔板培养293T细胞备用。质粒转染按Lipofectamine 2000操作说明进行：Lipofectamine 2000 0.5 μL和200 ng pcDNA3.1-NS1分别稀释于25 μL无血清DMEM中，孵育5 min，两者混合并轻轻混匀，室温放置20 min，加入转染融合度达80%的293T细胞，4～6 h后更换培养基，转染48 h后利用1.6制备的兔血清作为一抗，FITC标记羊抗兔为二抗，进行免疫荧光检测。以pcDNA3.1为对照。

1.8 Dot-ELISA方法的建立

以纯化的NS1′作为包被抗原建立检测NS1抗体的Dot-ELISA，方法如下：剪取适当大小的硝酸纤维素膜，以0.26 μg/mL为起始质量浓度进行2倍比稀释纯化NS1′，每点加样1 μL，37 ℃温箱干燥，50 g/L脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，PBST洗涤5次后，将1∶100稀释的H3N2 SIV感染猪血清(对照为H3N2灭活疫苗免疫猪血清)37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次，用1∶3 000稀释HRP标记的羊抗猪IgG 37 ℃作用30 min，PBST洗涤5次，置于AEC显色液中，至出现明显斑点后，蒸馏水漂洗终止显色，拍照记录结果。

2 结果与分析

2.1 NS1′基因的PCR扩增

PCR扩增获得了长度约为250 bp的NS1′基因片段(图1)，与预期片段长度一致。

2.2 pET32a-NS1′的鉴定

pET32a-NS1′ PCR扩增获得了约250 bp的片段(图2-A)， pET32a-NS1′的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定获得了约5 300和250 bp的DNA片段(图2-B)，与预期片段大小一致，表明NS1′基因已成功插入pET-32a(+)载体。NCBI BLAST分析结果表明，扩增基因与国内外多株SIVNS1基因对应序列的同源性≥99.5%。

2.3 重组蛋白NS1′的SDS-PAGE检测

SDS-PAGE检测结果(图3-A)显示，pET32a-NS1′经IPTG诱导表达了约34 ku的重组蛋白，而未诱导pET32a-NS1′转化菌和诱导的pET-32a(+)转化菌则未见相应条带，与预期结果一致，并且目的蛋白条带主要存在于超声裂解菌离心后的上清中，表明NS1主要抗原区为可溶性表达。

2.4 重组蛋白NS1′反应原性的检测

Western blotting结果(图3-B)表明，pET32a-NS1′诱导菌在约34 ku处有特异性条带，而未诱导pET32a-NS1′转化菌和诱导的pET-32a(+)转化菌则未见相应条带，表明诱导菌中表达的NS1′蛋白能够与SIV感染阳性血清发生特异性反应。

2.5 重组蛋白NS1′免疫原性的检测

免疫荧光试验结果表明，pcDNA3.1-NS1转染的293T细胞具有特异性绿色荧光(图4-A)，而pcDNA3.1转染的293T细胞则没有绿色荧光(图4-B)，这说明用重组蛋白NS1′制备的兔血清能与pcDNA3.1-NS1表达的NS1发生特异性反应，具有良好的免疫原性。

2.6 Dot-ELISA方法的建立

由Dot-ELISA显色结果(图5-A)可推算， 纯化NS1′能与H3N2 SIV感染猪血清反应，且呈现可见斑点的最小量是32.5 ng/μL， 而在对照(图5-B)中，以等量的纯化NS1′与H3N2灭活疫苗免疫猪血清反应，没有可见斑点，表明能将重组NS1′蛋白作为Dot-ELISA的包被抗原，来鉴别诊断SIV感染猪和灭活疫苗免疫猪。

3 讨 论

NS1是A型流感病毒的重要多功能毒力因子[7]，并且在A型流感病毒中较为保守[13]。由于猪流感灭活疫苗和NS1缺失致弱SIV 免疫猪不能产生针对NS1的抗体，而流感病毒感染猪可产生NS1抗体，因此，NS1抗体是鉴别猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪的理想靶标。为制备NS1抗原，多个研究小组都表达了SIV NS1[11,14-15]，但表达的重组蛋白NS1都存在于包涵体中，需要经过变性、复性、透析等复杂过程，才能获得有活性的NS1蛋白，不仅耗时费力，而且目的蛋白大量析出。

为了获得可溶性重组NS1，本研究从NS1蛋白、表达载体及表达菌株三方面进行改进，在利用DNAstar分析SIV A/swine/Henan/2/2008(H3N2) NS1主要抗原区的基础上，设计1对扩增NS1主要抗原区(NS1′)的引物，PCR扩增NS1′；为增加NS1′的可溶性，NS1′酶切后插入pET-32a(+)，构建pET32a-NS1′；由于Rosetta菌株可补充大肠杆菌缺乏的7种稀有密码子(AUA、AGG、 AGA、CUA、CCC、GGA及CGG)对应的 tRNA，因此有助于提高外源基因表达水平，并能促进目的蛋白的可溶性表达，因此，选用Rosetta菌株作为表达系统。结果表明，本研究成功表达了可溶性的H3N2 SIV NS1′，该蛋白具有良好的抗原性，并可用作包被抗原建立检测NS1抗体的Dot-ELISA，为鉴别诊断猪流感病毒感染猪和疫苗免疫猪奠定了基础，为有效监测猪群中流行的流感病毒提供了有效工具。另外，在NCBI BLAST分析中发现，本研究得到的H3N2亚型SIV河南株NS1的主要抗原区NS1′，与国内外多个SIV毒株NS1基因对应序列的同源性≥99.5%，有的可达100%，这说明将NS1′用作诊断抗原具有较好的代表性和实用性。

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Soluble expression of main antigen region ofNS1 gene from H3N2 SIV in Henan and development of Dot-ELISA detection method

ZHAO Pu1,2,SU Hong-liao3,LIU Xing-you1,2,ZHAO Kun1,2,HU Jian-he1,2,WANG San-hu1,2,YAO Si-xin1,2,ZHENG Yu-shu1,2

(1DepartmentofAnimalScienceandTechnology，HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang，Henan453003,China；2ResearchCenterforAnimalDiseasesControlandResiduesSupervision,Xinxiang，Henan453003,China; 3HuaxianAnimalHygienicSupervisionInstitute,Anyang，Henan456400，China)

【Objective】 This study aimed to express the soluble main antigen region(NS1′) ofNS1 gene,acquire NS1′ with good antigenicity,and develop Dot-ELISA method for detecting NS1 antibody so as to differentiate infected from vaccinated pigs.【Method】 Using pET28a-NS1 as template,NS1′ of H3N2 SIV in Henan was amplified by PCR,digested withEcoRⅠ andXhoⅠand cloned into prokaryotic expression vector pET-32a(+).The recombinant pET32a-NS1′ was identified by PCR,EcoRⅠ/XhoⅠdigestion and DNA sequencing.Expression of NS1′ was induced by IPTG in Rosetta and purified,and immune serum was prepared by vaccinating rabbits.The recombinant NS1′ was then analyzed by SDS-PAGE,Western blotting and immunofluorescence.Using NS1′ as coating antigen,Dot-ELISA detection method was developed.【Result】NS1′ of H3N2 SIV with length of ～250 bp was amplified by PCR and the recombinant pET32a-NS1′ was constructed.SDS-PAGE and Western blotting showed that the expressed protein NS1′ was ～34 ku and soluble and it also reacted specifically with serum from pig infected with SIV.Immune serum prepared with NS1′ recognized NS1 expressed in 293T cells.The established Dot-ELISA method was able to differentiate infected pigs from vaccinated pigs.【Conclusion】 NS1′ was successfully expressed in soluble form,expressed NS1′ has good antigenicity and Dot-ELISA method for detecting NS1 antibody was developed.

swine influenza virus;nonstructural protein 1;major antigen region;soluble expression;Dot-ELISA

2014-11-11

河南省基础与前沿技术项目(122300410135)；河南省教育厅自然科学研究项目(2011A230008)

赵 朴(1975-)，男，河南南阳人，讲师，硕士，主要从事动物病毒学及免疫学研究。E-mail：zhpu2008@163.com

郑玉姝(1977-)，女，内蒙古赤峰人，副教授，博士，主要从事动物病毒学及免疫学研究。 E-mail:yszheng2003@163.com

时间:2015-05-11 15:02

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.004

S852.65+1

A

1671-9387(2015)06-0035-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1502.004.html