宋 爽，崔 培，王尧尧，蒋书东，章孝荣，方富贵，李福宝

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

神经激肽B在大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴上的表达

宋 爽，崔 培，王尧尧，蒋书东，章孝荣，方富贵，李福宝

(安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036)

【目的】 探究初情期启动前、启动中、启动后大鼠下丘脑、垂体和卵巢中神经激肽B(Neurokinin B，NKB)的表达变化。【方法】 以SD雌性大鼠为研究对象，分别取大鼠的下丘脑、垂体和卵巢组织制作冰冻切片，运用免疫荧光染色法检测SD大鼠下丘脑、垂体和卵巢上NKB的分布。【结果】 NKB主要分布于各时期大鼠下丘脑的弓状核、腹内侧核、室旁核、腺垂体以及卵巢的黄体细胞、间质细胞。但NKB在不同时期表达水平不同，在初情期启动前(出生后25 d)和启动后(出生后60 d)表达最强，在初情期启动中最弱(P<0.05)。同一时期不同核团之间NKB表达水平也不同，初情期启动前和启动中室旁核最强，弓状核次之，腹内侧核最弱(P<0.05)；在初情期启动后，弓状核和腹内侧核中NKB的表达显著高于室旁核(P<0.05)。腺垂体中NKB在初情期启动时表达最强，初情期启动前次之，初情期启动后最弱(P<0.05)。卵巢间质细胞中NKB在初情期启动中的表达显著低于初情期启动前、后(P<0.05)。卵巢黄体细胞中NKB在初情期启动后表达最强，初情期启动时最弱。【结论】 NKB可能与初情期启动的调控密切相关。

神经激肽B；初情期启动；大鼠；下丘脑；垂体；卵巢

神经激肽B(Neurokinin B，NKB)又名神经介素K(Neurokinin K)，是速激肽家族(Tachykinin family)的一员[1]。NKB是Kimura等于1983年首先从猪脊髓中分离出来的含有10个氨基酸的多肽[2]。速激肽家族主要由P物质(SP)、神经激肽A(K物质)和NKB组成。Amstalden等[3]通过对IHH患者进行遗传学分析发现，NKB及其受体参与生殖调控。

初情期的启动是动物获得繁殖能力的标志，初情期启动始于下丘脑促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasinghormone，GnRH)脉冲式分泌的提高。研究显示，动物胚胎早期GnRH神经元有活化迹象，随后进入休眠状态，直至初情期启动才再次活化[4]。应用免疫细胞化学法结合腹腔注射荧光逆行示踪技术,可观察到GnRH神经元纤维束在大鼠下丘脑正中隆起处与NKB免疫阳性纤维密切交织，且GnRH神经元轴突表达NKB受体NK3R[5]，提示NKB可能参与GnRH神经元的再次活化，从而启动初情期。

目前关于NKB在大鼠[5]、绵羊[6]、猴子[7]、山羊[8]、小鼠[9]等动物生殖轴上分布的报道较多，但大多数仅涉及生殖轴中的某一个或几个部分的组织、器官。另外，关于生殖轴上NKB的分布及表达量仍存在争议，缺少对生殖轴整体的研究，而关于初情期启动前后动物生殖轴上NKB的表达变化更是鲜有报道。本试验运用免疫荧光技术对大鼠初情期启动前、启动中、启动后生殖轴上NKB的分布及表达变化进行了研究，旨在为NKB在初情期启动中的调控作用研究提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

处于发情周期不同阶段的SD雌性大鼠15只，其中初情期启动前(出生后25 d)、初情期启动中(阴门开启)、初情期启动后(出生后60 d)[10]各5只。

1.2 采样及切片制作

麻醉处死大鼠，取下丘脑、垂体、卵巢，放入已准备好的体积分数4%的多聚甲醛固定液中，固定12～24 h后取出，经0.1 mol/L PBS充分洗涤后，置于4 ℃的0.3 g/mL蔗糖溶液中直至组织沉底，随即制备冰冻切片，其中下丘脑切片厚度25 μm，垂体和卵巢均为8 μm。将冰冻切片放入盛有0.01 mol/L PBS(pH 7.4)的6孔板中待用。

1.3 切片的免疫荧光染色

将切片用钩环捞入24孔板用于免疫荧光染色。切片用PBS浸洗3次，每次10 min，用体积分数1% Triton(V(Triton)∶V(PBS)=1∶99)孵育10～20 min，用0.1 g/mL牛血清白蛋白封闭15 min，甩去封闭液，加入NKB一抗 (羊抗鼠NKB，SANTA CRUZ，编号sc-14109，稀释倍数1∶200)，置于湿盒内4 ℃孵育过夜。过夜孵育的切片用PBS洗3次，每次10 min，加入二抗IgGtR(用tR标记的兔抗山羊IgG，SANTA CRUZ，编号sc-2780，稀释倍数1∶200)，室温下避光孵育2 h， PBS 洗3次，每次10 min， DAPI染核2 min，避光条件下用PBS 洗3次，每次5 min，将组织切片置于滴有甘油的载玻片上，盖上盖玻片即可在显微镜下观察。最后将组织切片展贴于载玻片上。试验设置阴性对照组，一抗用PBS替代，其他步骤相同。

1.4 图像采集及分析

甘油封片后置于荧光显微镜(OLYMPUS DP72，奥林巴斯)下观察，然后拍照。运用Image-pro plus 6.0软件对阳性区域平均光密度值(Density mean)进行分析。平均光密度值用“平均值±标准差”表示，采用t检验分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 NKB在初情期启动前后大鼠下丘脑中的表达

免疫荧光显示，NKB免疫反应阳性细胞在荧光显微镜下有橙红色荧光，阴性对照组无荧光。不同发育时期所有大鼠下丘脑的弓状核、腹内侧核、室旁核均有NKB表达(图1)。由表1可知，不同时期的同一核团平均光密度值不同。初情期启动中，NKB在各个核团上的表达显著低于初情期启动前(P<0.05)；在弓状核和室旁核的表达显著高于初情期启动后(P<0.05)，在腹内侧核的表达显著低于初情期启动后(P<0.05)；在弓状核和室旁核，初情期启动前(出生后25 d)和启动后(出生后60 d)NKB的表达差异不显著(P>0.05)，而在腹内侧核初情期启动前和启动后差异显著(P<0.05)。同一时期不同核团平均光密度值也不同，初情期启动前和启动中，NKB在大鼠下丘脑室旁核中表达最强(P<0.05)，弓状核次之，腹内侧核最弱；初情期启动后NKB在大鼠下丘脑弓状核和腹内侧核中的表达显著高于室旁核(P<0.05)。

注：同行数据后标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，同列数据后标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different capital letters indicate significant difference in each row (P<0.05),different small letters indicate significant difference in each column (P<0.05).

2.2 NKB在初情期启动前后大鼠垂体中的表达

免疫荧光结果显示，阴性对照组无荧光；由表2可知，初情期启动前后大鼠腺垂体中均有NKB表达(图2)，但不同时期的表达强度不同。初情期启动中NKB在腺垂体中的表达水平显著高于初情期启动前和启动后(P<0.05)，而在初情期启动前和启动后NKB的表达强度之间无显著差异(P>0.05)(表2)。

注：同列数据后标不同字母表示差异显著(P<0.05)，“-”表示无NKB表达。

Note:Different letters in each column mean significant difference(P<0.05).“-” shows no NKB expression.

2.3 NKB在初情期启动前后大鼠卵巢中的表达

NKB在初情期启动前后大鼠卵巢中的表达见图3。免疫荧光染色结果显示，阴性对照组无荧光。NKB在各个时期大鼠卵巢间质细胞中均有表达，而在黄体细胞中只表达于初情期启动中和初情期启动后(图3)。由表2可知，初情期启动中在卵巢间质细胞中NKB表达水平显著低于初情期启动前和启动后(P<0.05)；且初情期启动前NKB在卵巢间质细胞中的表达强度显著高于初情期启动后(P<0.05)；在初情期启动中，卵巢黄体细胞中NKB表达程度显著低于初情期启动后(P<0.05)。

3 讨 论

雌性动物的生殖机能受下丘脑-垂体-卵巢轴的调控，且有多种神经递质共同参与，其中GnRH脉冲式分泌的激活是启动青春期的关键。

本试验结果表明，NKB主要分布于各时期大鼠下丘脑的弓状核、室旁核和腹内侧核。这与前人在小鼠[9]、大鼠[11]、猴子[12]、皖西白鹅[13]等动物上的定位研究结果部分相似。但与Navarro等[14]报道的大鼠下丘脑视上核存在NKB的研究结果不一致，这可能与抗体或者试验动物品种不同有关。

下丘脑NKB所在核团与GnRH神经元所在的正中隆起等部位毗邻。Seminara等[15]和Krajewski等[16]采用荧光逆行追踪结合免疫荧光双标记法研究发现，NKB神经纤维和GnRH神经纤维在正中隆起处交织，且该部位共存有NKB受体NK3R。下丘脑弓状核是促性腺激素分泌的主要调控中心，弓状核上有NKB神经元，则说明NKB和GnRH神经元可能存在结构和功能上的紧密关系。近期人类基因学研究发现，编码NKB和其受体的基因功能缺失会导致促性腺激素分泌不足从而造成性腺功能减退甚至不育[3]，提示NKB可能是调控生殖的又一重要因子。Navarro等[9]研究认为，GPR54和NK3R激活对初情期前小鼠性腺轴的作用是一致的：给性腺切除小鼠脑室内注射NKB激动剂后发现kiss1神经元C-fos mRNA表达增加，而kiss1神经元具有促进GnRH分泌的作用[17]，被认为是初情期启动的“看门人”[11]，可见NKB可能通过kiss1调控初情期启动。García-Galiano等[18]报道TA3C基因位于kiss1神经元的上游，直接或间接作用于kiss1神经元以调节生殖功能。由此笔者认为，NKB可能在初情期启动前、后直接参与对GnRH的调节作用，这与Navarro等[9]认为“NKB直接激活KNDy神经元随后驱动GnRH神经元和促性腺激素分泌”的研究结果类似。此外，研究表明，大鼠GnRH分泌呈周期性变化，初情期启动前分泌显著增加，排卵前的分泌量最大，初情期启动后次之，启动中的分泌量最少[19]。

而本试验发现，初情期启动前、启动后大鼠下丘脑各核团上NKB的表达量显著高于初情期启动中，这与GnRH的分泌规律存在一定相似处。初情期启动前，机体内源性性腺激素水平骤降，低水平的性腺激素能够负反馈刺激下丘脑分泌GnRH，而此时下丘脑的NKB表达量最高，Kauffman等[20]在卵巢摘除小鼠的试验中也得到了相似的结论。提示下丘脑NKB可能参与性腺激素对GnRH的调控从而调控大鼠初情期的启动。但是关于NKB到底是通过何种方式参与生殖调控以及在生殖调控中的路径等问题还不甚明确，有待于进一步的研究。

本研究首次报道了NKB在大鼠垂体和卵巢上的定位分布。脑垂体是动物体内重要的内分泌腺，是调节机体生理平衡的总开关，在代谢、生长、发育和生殖等方面起着重要的调节作用。垂体分为神经垂体和腺垂体。其中腺垂体是内分泌系统的重要调控枢纽，受下丘脑释放激素和靶腺激素的双重调节[21]。已有的研究发现，下丘脑弓状核上的NKB通过传出神经元进入垂体门脉循环从而影响垂体前叶LH和FSH释放[22]。Billings等[23]在母羊上发现，NKB可以促进LH分泌。且Ruiz-Pino等[24]研究表明，NKB受体激动剂对于雌性大鼠LH分泌有持续性的兴奋作用，提示NKB可能通过腺垂体参与下丘脑-垂体-性腺轴的调控作用，进而影响促性腺激素的分泌。Mijiddorj等[25]于2012年发现NKB在脑垂体的GH3细胞系中参与促进催乳素的分泌。说明NKB可直接作用于脑垂体。本试验结果表明，NKB主要在腺垂体上表达，神经垂体上未见分布。提示NKB可能直接作用于腺垂体调控生殖作用。

本试验结果表明，NKB在各个时期大鼠卵巢间质细胞以及启动中和启动后大鼠黄体细胞中均有不同程度的表达。而卵巢间质细胞能够合成雄激素，卵巢黄体细胞参与机体雌激素和孕激素的合成与分泌，提示NKB可能与性腺激素的合成和分泌有关。本研究结果表明，初情期启动后大鼠卵巢黄体细胞上的NKB表达最强，初情期启动中最弱。Rance等[26]研究发现，绝经妇女的弓状核神经元肥大，NKB表达增加。切除卵巢的雌猴和鼠其下丘脑NKB表达亦增加，切除睾丸的动物也有同样的现象发生[27-28]。另外，给予性腺切除的动物雌激素治疗能够抑制NKB表达，表明NKB表达增加是由于卵巢雌激素分泌减少造成的[27]。由此可见，高水平的雌激素不仅能够抑制下丘脑NKB的表达，而且能够下调卵巢上NKB的表达。Navarro等[27]也发现，NKB信号肽在雌性大鼠初情期启动中呈弱阳性表达，提示NKB可能通过调节性腺激素的分泌从而参与机体生殖和发育过程。

综上所述，NKB在雌性大鼠的下丘脑、腺垂体以及卵巢中均有不同程度的表达，且在初情期启动前、后表达最强，揭示NKB可能在初情期启动的过程中有重要的作用。有关NKB对初情期启动以及对激素调节的作用机制还有待进一步的研究。

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Expression of Neurokinin B in hypothalamus,pituitary and ovary of rats

SONG Shuang,CUI Pei,WANG Yao-yao,JIANG Shu-dong, ZHANG Xiao-rong,FANG Fu-gui,LI Fu-bao

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 This study aimed to investigate the change in expression of Neurokinin B (NKB) in hypothalamus,pituitary and ovary of rats at prepuberty,puberty-onset and post puberty.【Method】 Females SD rats were selected and their hypothalamus,pituitary and ovary were taken for frozen section before immunofluorescence staining technology was used to detect the distribution of NKB in hypothalamus,pituitary and ovary.【Result】 NKB was mainly distributed in arcuate nucleus,ventromedial hypothalamic nucleus,paraventricular nucleus of the hypothalamic,adenohypophysis cells,and corpus luteum cells and stromal cells of ovary of rats.Expression intensity of NKB in hypothalamu was different at different periods with the strongest expression at prepuberty (on postnatal 25th day) and post puberty (on postnatal 60th day) (P<0.05) and the weakest at puberty-onset (P<0.05).Different nucles had different expression levels at the same time,at prepuberty and puberty-onset the strongest expression was found in the paraventricular nucleus followed by arcuate nucleus,while the weakest was in the ventromedial hypothalamic nucleus (P<0.05);while at post puberty,the strongest expression was found in arcuate nucleus and ventromedial hypothalamic nucleus,while the weakest expression was in the paraventricular nucleus.The strongest expression intensity of NKB in pituitary was found at puberty-onset,followed by prepuberty and post puberty (P<0.05).Expression intensity of NKB in stromal cells of ovary at puberty-onset was significantly lower than that at prepuberty and post puberty (P<0.05).The weakest expression intensity of NKB was found at puberty-onset,while the strongest expression was at post puberty in stromal cells of ovary.【Conclusion】 NKB may be closely related to the control of puberty onset.

NKB;puberty onset;rats;hypothalamus;pituitary;ovary

2014-01-01

高等学校博士学科点专项科研基金博导类资助课题(20123418110004)；安徽省自然科学基金项目(1208085MC39)

宋 爽(1986-)，女，河南南阳人，硕士，主要从事动物解剖与生殖内分泌研究。E-mail：shuangalice2011@163.com

李福宝(1953-)，男，安徽固镇人，教授，主要从事动物解剖与生殖内分泌研究。E-mail:lfb@ahau.edu.cn

时间:2015-05-11 15:03

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.06.023

S852.1

A

1671-9387(2015)06-0007-08

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150511.1503.023.html